1、1 土壤微生物量碳測定方法及應用土壤微生物量碳（ soil microbial biomass）不僅對土壤有機質和養分的循環起著主要作用，同時是一個重要活性養分庫，直接調控著土壤養分（如氮、磷和硫等）的保持和釋放及其植物有效性。近40 年來，土壤微生物生物量的研究已成為土壤學研究熱點之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(microbial biomass carbon, bc)來 表 示 土 壤 微 生 物 生 物 量 的 大 小 。 測 定 土 壤 微 生 物 碳 的 主 要 方 法 為 熏 蒸 培 養 法（fumigation-incubation, fi）和熏蒸

2、提取法（ fumigation-extraction, fe） 。熏蒸提取法（ fe法）由于熏蒸培養法測定土壤微生物量碳不僅需要較長的時間而且不適合于強酸性土壤、加入新鮮有機底物的土壤以及水田土壤。voroney (1983) 發現熏蒸土壤用 0.5mol l-1k2so4提取液提取的碳量與生物微生物量有很好的相關性。vance 等(1987) 建立了熏蒸提取法測定土壤微生物碳的基本方法：該方法用0.5mol l-1k2so4提取劑（水土比 1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有機碳含量用重鉻酸鉀氧化法測定；以熏蒸與不熏蒸土壤提取的有機碳增加量除以轉換系數kec(取值 0.38) 來計算

3、土壤微生物碳。wu等（1990）通過采用熏蒸培養法和熏蒸提取法比較研究，建立了熏蒸提取碳自動一起法測定土壤微生物碳。該方法大幅度提高提取液中有機碳的測定速度和測定結果的準確度。林啟美等（1999） 對熏蒸提取 - 重鉻酸鉀氧化法中提取液的水土比以及氧化劑進行了改進，以提高該方法的測定結果的重復性和準確性。對于熏蒸提取法測定土壤微生物生物碳的轉換系數kec的取值，有很多研究進行了大量的研究。測定 kec值的實驗方法有：直接法（加入培養微生物、用14c底物標記土壤微生物）和間接法（與熏蒸培養法、顯微鏡觀測法、atp法及底物誘導呼吸法比較） 。提取液中有機碳的測定方法不同（如氧化法和儀器法） ，那么

4、轉換系數kec取值也不同，如采用氧化法和一起法kec值分別為 0.38 （vance 等，1987）和 0.45 （wu等，1990） 。不同類型土壤（表層）的kec值有較大不同， 其值變化為 0.20-0.50 （sparling等，1988，1990；bremer 等，1990） 。dictor等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同濃度土層土壤的轉換系數kec有較大的差異，從表層0-20cm土壤的 kec為 0.41 ，逐步降低到 180-220cm土壤的 kec為 0.31。一、基本原理熏蒸提取法測定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤時由于微生物的細胞膜被氯仿破壞而殺死，微生物中部分組

5、分成分特別是細胞質在酶的作用下自溶和轉化為k2so4溶液可提取成分 （joergensen,1996 ） 。 采用重鉻酸鉀氧化法或碳-自動分析儀器法測定提取液中的碳含量，以熏蒸與不熏蒸土壤中提取碳增量除以轉換系數kec來估計土壤微生物碳。二、試劑配制（1） 硫酸鉀提取劑 （0.5mol l-1） ：取 871.25g 分析純硫酸鉀溶解于蒸餾水中，定溶至 10l。由于硫酸鉀較難溶解，配制時可用20l 塑料桶密閉后置于苗床上（60-100rev min-1）12 小時即可完全溶解。（2） 0.2 moll-1（1/6k2cr2o7）標準溶液：稱取 130烘 2-3 小時的 k2cr2o7（分析純）

6、9.806g于 1l 大燒杯中， 加去離子水使其溶解，定溶至1l。k2cr2o7較難溶解，可加熱加快其溶解。（3） 0.1000 mol l-1（1/6k2cr2o7） 標準溶液：取經 130烘 2-3 小時的分析純重鉻酸鉀4.903g，用蒸餾水溶解并定溶至1l。2 （4） 鄰啡羅啉指示劑：取鄰啡羅啉指 1.490g 溶于含有 0.700g 分析純硫酸亞鐵（feso4 7h2o ）的 100ml 蒸餾水中，此溶液易變質，應密閉保存于棕色瓶中。（5） 硫酸亞鐵標準溶液（ 0.05 mol l-1） ：稱取 13.9g 分析純硫酸亞鐵（ feso47h2o ） ，溶于 800ml 蒸餾水中，慢慢加

7、濃硫酸5ml（防止水解），定溶至 1l，保存于棕色瓶中。此溶液易被空氣氧化，每次使用時必須標定其準確濃度：硫酸亞鐵溶液標定方法： 吸取 0.1000 moll-1（1/6k2cr2o7）標準溶液 5.0ml（濃度為 0.05 moll-1，1/6k2cr2o7） ，放入 150ml 的三角瓶中，加濃硫酸5ml 和鄰啡羅啉指示劑2 滴，用硫酸亞鐵溶液滴定，滴至溶液由藍綠色變為棕紅色即為終點。根據滴到終點消耗的硫酸亞鐵溶液量計算其準確濃度，即c2=(c1*v1)/v2。式中： c1 重鉻酸鉀標準溶液濃度（0.1000 mol l-1） c2硫酸亞鐵標準溶液濃度（moll-1） v1吸取的重鉻酸鉀標

8、準溶液體積（5ml） v2滴到終點時消耗硫酸亞鐵溶液體積（ml）（6）去乙醇氯仿制備：在通風櫥中，將分析純氯仿與蒸餾水按1：2（v:v）加入分液漏斗中，充分搖動 1 分鐘，慢慢放出底層氯仿于燒杯中。如此洗3 次。得到的純氯仿用無水氯化鈣出去氯仿中的水分，于試劑瓶中在低溫（4）黑暗狀態可保存幾周（williamss等，1995）三、儀器設備：phoenix8000 碳- 自動分析儀， 50ml 可調移液器，往復式振蕩器（300 rev min-1） ，50ml燒杯， 50ml 聚乙烯瓶， 125 ml 聚乙烯瓶， 150ml 消化管（ 24*295mm ） ，250ml 三角瓶， 50ml酸式滴

9、定管。土壤篩（孔徑2mm ） ，22cm真空干燥器，水泵抽真空裝置，ph-自動滴定儀。四、操作方法：（1） 土樣前處理：新鮮土壤應立即處理或保存于4冰箱 中，測定前 仔細除去土樣中可見植物殘體（如根、莖和葉 ）及土壤動物（蚯蚓等） ，過篩（孔徑2mm ） ，徹底混勻。處理過程應盡量避免破壞土壤結構， 土壤含水量過高應在室內適當風干，以手感濕潤疏松但不結塊為宜（約為飽和持水量的 40% ） 。土壤濕度不夠可以用蒸餾水調節至飽和持水量的40% 。次樣品即可用于土壤實時測定。開展其他研究（如培養試驗）可將土壤置于密閉的大塑料桶內培養7-15 天，桶內應有適量水以保持濕度，內放一小杯1 mol l-1

10、naoh溶液吸收土壤呼吸產生的co2，培養溫度為25. 經過前培養的土壤應立即分析。如果需要保留，應放置于4的冷藏箱中，下次使用前需要在上述條件下至少培養24 小時。這些過程為消除土壤水分限制對微生物的影響，及植物殘體組織對測定的干擾。土壤飽和持水量 測定可按 shaw （1958）的方法：在圓形漏斗莖上裝一帶夾子的橡皮管，漏斗內塞上玻璃纖維塞，取50g 土壤于漏斗中，夾緊橡皮塞，加入50ml 水保持 30 分鐘，然后打開夾子并測定30 分鐘內滴下的水的體積， 加入的水量減以滴下的水量再加原來土壤中含的水量即為該土壤的飽和含水量。（2） 土壤熏蒸稱取經前處理的新鮮土壤（含水量為飽和持水量的40

11、% ）3 份 25.0g （烘干基重）土樣于50ml 燒杯中，用去乙醇氯仿熏蒸，方法是將其置于底部有少量水（約200ml）和去乙醇氯仿（40ml）的真空干燥器中，氯仿加入燒杯中，并在其中放入經濃硫酸處理的碎瓷片（0.5cm大小，防爆）。在-0.07mpa 真空度下使氯仿劇烈沸騰3-5 分鐘后，關閉真空干燥器閥門，移置在 25黑暗條件下熏蒸土壤24 小時；然后將土壤轉入另一干凈真空干燥器中，反復抽真空（-0.07mpa）6 次，每次 3 分鐘，徹底出去土壤中氯仿（殘留在土壤中的氯仿對提取碳的測定有較大的影響 ） 。在熏蒸同時，另取3 份 25.o(烘干基重 )土壤于 125ml 提取瓶中（為 不

12、熏蒸對照 ） 。由于熏蒸過程需要 24小時，因此通常在熏蒸時，將不熏蒸土壤可置于 4條件下保存 。（3） 土壤提取3 將除去氯仿后的熏蒸土壤轉移到125ml 提取瓶中，與不熏蒸土壤同時采用50ml 可調加液器加入 100ml0.5mol l-1k2so4提取液，水土比為1：4，并設 3 個試劑空白。如果采用重鉻酸鉀氧化法測定提取液中有機碳，也可采用2： ；1 的水土比，即加入 50ml0.5mol l-1k2so4提取液。在往復式振蕩器中振蕩（ 300 rev min-1）提取 30 分鐘，再用定量中速濾紙過濾于50ml 塑料瓶中，貯藏于 -18冷凍柜中，待測。經貯藏的土壤提取液解凍后會有一些

13、白色沉淀，據推測為 caso4和4k2so4，對提取液中有機碳的測定沒有影響，可以不必除去這些白色沉淀 （brookes等，1985） 。（4） 提取液中有機碳含量測定和土壤微生物碳計算：方法：重鉻酸鉀氧化法（林啟美等1999；vance等 1987）吸取 10ml 上述土壤提取液于經過仔細檢查的150ml 消化管 （24*295mm ） 中， 加入 5.0ml0.2 moll-1k2cr2o7，5.0ml 濃 h2so4溶液，再加入少量經濃硫酸處理的碎瓷片（3mm 大小，防爆），混勻，置于1751磷酸浴中煮沸10 分鐘，應注意消煮的時間應保證準確一致。冷卻后將溶液轉移到 150ml三角瓶中，

14、使總體積約為 80ml， 加入 1 滴鄰啡羅啉指示劑， 用 0.05 mol l-1硫酸亞鐵標準溶液滴定消煮液中剩余的重鉻酸鉀，滴定過程為先由橙黃色變為藍綠色，再變為棕紅色，即到達終點。結果計算：提取的土壤有機碳（ mgckg-1土）=0.012/4*106*m*(v0-v)*f/w 式中： m 為 feso4溶液濃度（ moll-1） ； v0、v分別為滴定空白和樣品消耗的feso4溶液體積（ ml） ； f為稀釋倍數； w為烘干土重（ g） ； 0.012為碳毫摩爾質量（g） ； 106為換算系數。土壤微生物碳： bc=ec/kc 式中： bc 代表土壤微生物碳（ mgckg-1） ； e

15、c=熏蒸土壤提取的有機碳 - 不熏蒸土壤提取的有機碳，單位mgckg-1； kc為轉換系數，采用重鉻酸鉀氧化法取值0.38 （vance等，1987） 。方法：碳 - 自動分析儀器法（ wu等，1990）取 10ml 土壤提取液于 40ml 樣品瓶中。加入 10ml，5% 六偏磷酸鈉溶液（ ph2.0） ，使提取液中的沉淀（caso4和4k2so4） 全部溶解。再用直徑為 2mm 的細管向樣液中通過高純度氮氣 （5-10分鐘） ，以除去溶解在樣液中的co2，然后用 phoenix8000 碳- 自動分析儀測定，待測提取液中的有機碳在 硫酸鉀 溶液作用下于紫外氧化室中氧化為co2， 該儀器可自動測定有機碳氧化放出的 co2量，通過工作曲線即可計算出提取液中的碳含量。工作曲線制備： 分別吸取 0、0.5 、1、2、3、4ml 濃度為 1000mgcl-1鄰苯二甲酸鉀標準溶液溶于50ml 容量瓶中，用高純度去離子水定容，即為 0、10、20、40、60、80 mgcl-1系列標準碳溶液。