1、 器官移植配型理論與技術基本概念基本概念n廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細胞置換病變或功能缺失的器官、組織或細胞，以維持和重建機體的生理功能。n影響移植成功的關鍵因素是可能發生的免疫排斥反應；一一. . 基本概念基本概念人人人人豬豬相關概念相關概念同種異體移植異種移植同系移植移植自體移植引起排斥反應的抗原nabo血型抗原；n組織特異性抗原；n主要組織相容性抗原(mha, major histocompatibility antigen )，又稱人類白細胞抗原（hla）;n次要組織相容性抗原（mha, minor histocompatibility antigen ）h-y抗原

2、;hla的基因結構、抗原結構及特點n由第6號染色體短臂21.31區編碼，按功能分為hla-i,三個區域，其中i,區編碼抗原與移植關系密切。hla-i類抗原主要由a、b、c位點編碼；hla-類抗原由dr、dp、dq位點編碼；nhla-i類抗原是由第6號染色體相應i類基因編碼的鏈與第15號染色體編碼的2微球蛋白非共價鍵結合的糖蛋白，主要表達在有核細胞表面；nhla-類抗原由第6號染色體相應類基因編碼的鏈和鏈非共價鍵結合的糖蛋白，主要表達在抗原遞呈細胞，胸腺上皮細胞表面；hla抗原的生物學功能n1.參與蛋白質抗原的處理與遞呈；n2.調節免疫應答；n3.參與t細胞分化過程；n4.介導同種免疫應答；hl

3、a基因的遺傳特點n1.高度多態性；hla基因呈現多位點復等位的特點；n2.共顯性遺傳：每對等位基因同時表達；n3.單倍型遺傳：位于同一條染色體上的 hla各位點的基因組合；n4.連鎖不平衡：單倍型基因非隨機分布的現象；2.傳統的hla分型技術n血清學分型:補體依賴的細胞毒實驗;n待測淋巴細胞與已知抗體孵育，再加入補體，若該抗體與淋巴細胞膜上hla分子相匹配，則激活補體系統導致待測細胞膜的破壞，否則細胞膜完整不受影響。n局限性：需要活的淋巴細胞；存在交叉反應；隱蔽抗原無法識別；人為影響因素多質控難做；n細胞學分型：混合淋巴細胞培養技術；n受者淋巴細胞與已知類型的淋巴細胞或者供者淋巴細胞混合培養，

4、兩種細胞hla分子表型如果相同則不能刺激淋巴細胞增殖，反之則刺激淋巴細胞增殖，分為單雙向兩種類型。n局限性：需要活的純合子表型的淋巴細胞；增殖檢測方法要用到同位素；分子生物學技術分型nhla抗原蛋白分子的多態性取決于相應編碼基因的多態性；nrflp/pcr-rflp/pcr-ssp;npcr-sscp;npcr-sequencing；npcr-sso/基因芯片技術；n流式細胞儀技術；n氨基酸殘基配型標準分析技術；聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應（pcr） 在多聚合酶，在多聚合酶，引物，底物和模引物，底物和模板的參與下通過板的參與下通過變性，退火，延變性，退火，延伸三個循環步驟伸三個循環步驟在短時間內達

5、到在短時間內達到對目的片斷的大對目的片斷的大量擴增，是基因量擴增，是基因分型的基礎。分型的基礎。rflp/pcr-rflp/pcr-ssp/基因組基因組dna 提取提取 酶切酶切 電泳分析電泳分析（rflp） dna 擴增（共性引物擴增（共性引物/特異性引物）特異性引物） (限制性內切酶酶切限制性內切酶酶切) 電泳檢測電泳檢測(pcr-rflp/pcr-ssp) pcr-sscp（單鏈構象多態性）n提取基因組提取基因組dna pcr擴增（特異引物）擴增（特異引物） 變性變性(雙雙鏈鏈 單鏈單鏈) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據帶型根據帶型可檢出基因的多態性又可檢出點突變，有利于發現

6、新可檢出基因的多態性又可檢出點突變，有利于發現新的等位基因的等位基因pcr-sequencingn提取基因組提取基因組dna pcr擴增（非特異擴增（非特異/特異引物）特異引物）dna測序測序n最可靠、直接、準確的最可靠、直接、準確的hla分型方法；分型方法；n臨床上應用限制了供體的來源；臨床上應用限制了供體的來源；n在確定等位基因的多態性、發現新位點、基因定位等在確定等位基因的多態性、發現新位點、基因定位等研究領域應用較多；研究領域應用較多；pcr-sso（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術n正向雜交：正向雜交：提取基因組提取基因組dna pcr擴增（共性引物）擴增（共性引物） 將將

7、pcr產物固定在固相支持載體上并進行變性處理產物固定在固相支持載體上并進行變性處理 與標記的特異性與標記的特異性寡核苷酸探針變性雜交寡核苷酸探針變性雜交 根據雜交信號判斷根據雜交信號判斷hla類型；類型；n反向雜交：反向雜交：將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上 與標記與標記的的pcr產物（已經變性處理）雜交產物（已經變性處理）雜交 根據雜交信號判斷根據雜交信號判斷hla類類型；型；n基因芯片技術是一種反向基因芯片技術是一種反向pcr-sso方法，具有高通量、縮微化、方法，具有高通量、縮微化、自動化程度高、準確性高等優勢；自動化程度高、準確性高等優勢；流式細

8、胞儀技術n提取基因組提取基因組dna 非特異性非特異性pcr擴增擴增 變性處理變性處理 與包被了特異性與包被了特異性hla探針的微球結合探針的微球結合 洗脫處理洗脫處理 通過流式細胞儀檢測通過流式細胞儀檢測n利用流式細胞儀技術將反向的固相利用流式細胞儀技術將反向的固相pcrsso技術變技術變為液相檢測分析技術；為液相檢測分析技術；n每種包被了不同類型每種包被了不同類型hladna探針的微球對應一種探針的微球對應一種熒光染色能夠被流式細胞儀識別；熒光染色能夠被流式細胞儀識別；n具有高通量、準確快速的優勢；具有高通量、準確快速的優勢；氨基酸殘基配型標準分型技術n根據hla分子346個氨基酸殘基中對

9、移植物排斥與存活率具有重要影響的關鍵氨基酸，當供受者的關鍵氨基酸殘基相同，盡管接受hla抗原部分錯配的供體，產生的免疫反應性仍然是低反應性或無免疫反應性，從而使移植物得以長期存活。hla分型技術臨床應用評價n1.在器官移植中具有重要臨床意義； 六位點配型原則：hla-a/b/drn2.合理選擇hla基因分型技術； 各種方法相互補充，難以相互替代，根 據不同需求選擇不同方法方方法法血清學分型血清學分型/ /細細胞分型胞分型基因分型基因分型(ssp/ssop/sb)(ssp/ssop/sb)識識別別位位點點hlahla分子抗原特分子抗原特異性，某些氨基異性，某些氨基酸殘基位點酸殘基位點dnadna

10、序列差異序列差異分分辨辨率率低（抗原特異性）低（抗原特異性）hla-a01hla-a01低（抗原特異性）低（抗原特異性）/ /中等（集團特中等（集團特異性）異性）/ /高（等位基因特異性）高（等位基因特異性）hla-ahla-a* *0101；hla-ahla-a* *0101/0102/01030101/0102/0103； hla-ahla-a* *0101020301010203抗原法抗原法/ /基因法基因法1.1.字母字母hlahla代表染色體上一段特代表染色體上一段特殊的遺傳區域（人類白細胞殊的遺傳區域（人類白細胞表面抗原區域）；表面抗原區域）；2.2.a/b/dra/b/dr代表該區域某一具體代表該區域某一具體的基因座位；的基因座位；3.3.數字代表該基因座位編碼的數字代表該基因座位編碼的特異性抗原（血