1、己酸菌復(fù)壯培養(yǎng)技術(shù)試驗(yàn)與研究來(lái)源：錄入時(shí)間：06-05-14 11:22:34摘要針對(duì)己酸菌實(shí)際生產(chǎn)，探討釆用更換培養(yǎng)基的方式進(jìn)行菌種復(fù)壯，并在培養(yǎng)過(guò)程屮進(jìn)行 種子熱處理試驗(yàn)、己酸菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定、接種量対己酸菌生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)、己酸菌種子染 菌后的處理試驗(yàn)等等。通過(guò)大量試驗(yàn)分析，得出較優(yōu)的培養(yǎng)和檢測(cè)方案，并將優(yōu)良種子直接 用于人生產(chǎn)。實(shí)踐證明，具有很強(qiáng)的實(shí)用性和較人的技術(shù)參考價(jià)值。關(guān)鍵詞：己酸菌復(fù)壯培養(yǎng)己酸菌培養(yǎng)是各大白酒企業(yè)近年來(lái)重要的科研項(xiàng)目，是窖池養(yǎng)護(hù)和人工窖泥培養(yǎng)的 棊礎(chǔ)，也是提高白酒質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。但在英生產(chǎn)及應(yīng)用過(guò)程中，工藝還不是非常成熟，存 在很多需耍探討研究的問題，需要尋找更佳

2、的培養(yǎng)方案，以提高質(zhì)量，降低成本。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，我們對(duì)己酸菌培養(yǎng)前期的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了認(rèn)真、多次的反復(fù)的 研究，總結(jié)出了一套經(jīng)濟(jì)冇效的己酸菌菌種復(fù)壯方法，通過(guò)種了熱處理試驗(yàn)、接種屋對(duì)己酸 菌生長(zhǎng)影響試驗(yàn)、進(jìn)行己酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定，得出了最佳方案，并探討出較好的檢測(cè)記錄方 法。1培養(yǎng)方案1.1培養(yǎng)基的制備1蛋白腺培養(yǎng)基1.1.1.1蛋白w 1.5%,乙酸鈉0.5%,葡萄糖0.5%,牛肉膏0.2%,磷酸氫二鉀0.05%,硫酸 鞍0.03%,硫酸鎂0.01%,調(diào)節(jié)ph7.07.2,于0.12mpa高壓滅菌30分鐘。1.1.1.2稱1%碳酸鈣單獨(dú)滅菌，接種前連同2%乙醇一并加入。1.1.2乙酸鈉培養(yǎng)基

3、1.1.2.1乙酸鈉1%,酵母膏0.1%,硫酸鍍0.05%，磷酸氫二鉀0.04%,硫酸鎂0.02%,調(diào) 節(jié)ph6.97.2,于0.12mpa高壓滅菌30分鐘。1.1.2.2稱1%碳酸鈣單獨(dú)滅菌，接種前一并加入2%乙醇。1.2己酸菌種子培養(yǎng)方式121復(fù)壯培養(yǎng)：収己酸菌種子100ml倒入150ml滅菌小三角瓶屮，包扎示于9()°c水浴屮 處理10分鐘，然后立即倒入培養(yǎng)基中，搖勻后置于35°c恒溫箱中培養(yǎng)710天。1.2.2擴(kuò)大培養(yǎng)：取己酸菌種子100ml直接加入乙酸鈉培養(yǎng)基(1l)屮，包扎搖勻后置于 35°c恒溫箱中培養(yǎng)5天，每天觀察記錄產(chǎn)氣狀況。1.3采用蛋口陳培養(yǎng)

4、基及乙酸鈉培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)壯種子對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果1.3.1采用蛋口h東培養(yǎng)基進(jìn)行己酸菌種子的復(fù)壯培養(yǎng),共進(jìn)行3批,第六天測(cè)得結(jié)呆為2.85、 2.515、2.65 億/ml。1.3.2采用蛋白腺培養(yǎng)基更換乙酸鈉培養(yǎng)基的方式進(jìn)行己酸菌種子復(fù)壯培養(yǎng)，菌數(shù)極多，只 是菌體較為瘦弱。可以看出，采用蛋白月東培養(yǎng)基在技術(shù)上具有可行性，但用于大生產(chǎn)每噸成 本達(dá)1339.6元，而乙酸鈉培養(yǎng)基僅為160.5元，高7.3倍，用蛋白jj東培養(yǎng)基不具有經(jīng)濟(jì)上的 可行性。因此，考慮將蛋白腺培養(yǎng)基種了轉(zhuǎn)接到乙酸鈉培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)人培養(yǎng)。1.3.3采用乙酸鈉培養(yǎng)蘋培養(yǎng)己酸菌液，使用蛋白月東培養(yǎng)基種了予以轉(zhuǎn)接，剛開始效果不甚 理想，

5、經(jīng)多批次轉(zhuǎn)接試驗(yàn)，最高達(dá)1.6億/ml,正常培養(yǎng)較高吋達(dá)1.3-1.4億個(gè)/ml,完全滿足 生產(chǎn)需要，采用更換培養(yǎng)基的方式進(jìn)行生產(chǎn)育種，操作簡(jiǎn)便，效果良好，具有實(shí)用性，生產(chǎn) 中可半年至一年實(shí)施一次。2己酸菌種了處理及取樣檢測(cè)方法探討2.1己酸菌種子熱處理12.1.1熱處理的目的：-是殺死雜菌及己酸菌繁殖體，純化菌種；二是激活己酸菌種，促進(jìn) 其迅速繁殖。2.1.2己酸菌熱處理的方式：傳統(tǒng)采用8()°c熱處理1()分鐘，但在實(shí)施屮存在一個(gè)問題，實(shí) 際溫度是以水浴溫度計(jì)為準(zhǔn)，則實(shí)際達(dá)不到種子液80°c的溫度要求，而以處理種子液測(cè)溫 操作較為不便，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，我們略作改進(jìn)，采用90

6、°c水浴處理，效果較為理想。2.2己酸菌細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)方法22.2.1采用血球計(jì)數(shù)板方法2.2.1.1取己酸菌液lml加入9ml蒸懈水屮，用吸管吸放數(shù)次。221.2用吸管加1滴稀釋的己酸菌液加于計(jì)數(shù)板上，然后用干凈蓋玻片輕輕自一邊向另一 邊壓下，再用兩只手的手指緊壓蓋玻片兩邊，使蓋玻片與計(jì)數(shù)板完全密合。2.2.1.3數(shù)分鐘后，待菌體細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板表面，在40倍物鏡下計(jì)數(shù)。2.2.1.4計(jì)數(shù)時(shí)，在25x16計(jì)數(shù)板上，取左上、右上、左下、右卜-及中間五個(gè)大格共80個(gè) 小格的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)吋，凡大格線上的細(xì)胞只計(jì)上方及右方線上的細(xì)胞。2.2.1.5計(jì)數(shù)完畢，將計(jì)數(shù)板在水龍頭上沖洗，切勿用硬物

7、洗刷，洗完后自行晾干。2.2.1.6計(jì)算：1ml己酸菌細(xì)胞數(shù)=(80小格細(xì)胞數(shù)4-80) x400x 10000x 10=80小格己酸菌細(xì)胞數(shù)x 5000002.2.2關(guān)于血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)2.2.2.1使用計(jì)數(shù)板檢測(cè)的缺點(diǎn)：由于己酸菌菌體小，僅為59xl.()nm左右,因此不能完 全沉降到計(jì)數(shù)板表面，造成計(jì)數(shù)不完全，形成誤差，使絕對(duì)誤差的存在不可避免。2.2.2.2使用計(jì)數(shù)板檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)及吋，能夠很快反饋給生產(chǎn)班組指導(dǎo)生產(chǎn)；測(cè)量相對(duì) 誤差小，對(duì)于各批次之間的比較尤為適用；化驗(yàn)成本低，兒乎不消耗藥詁。2.3取樣方式的確定2.3.1靜置取樣與搖勻取樣對(duì)檢測(cè)結(jié)果的彩響直接用吸管從燒瓶屮

8、吸取iml,測(cè)得細(xì)胞數(shù)為0.39億個(gè)/ml,搖勻后取樣測(cè)得細(xì)胞數(shù)為0.865 億個(gè)/ml,約為不搖勻吋的2.2倍。可見収樣均勻打否對(duì)測(cè)得結(jié)果影響重大，測(cè)時(shí)必須混合 均勻。2.3.2樣品混勻的方式2.3.2.1燒瓶?jī)?nèi)的菌液低于細(xì)頸下方，可宜接混勻取樣。2.322燒瓶?jī)?nèi)的菌液液面位于細(xì)頸上方，先是采用滅菌膠塞塞口倒置反復(fù)振蕩，考慮染菌 機(jī)會(huì)較大，采用滅菌吸管取樣吋用吸管攪勻取樣，效果不錯(cuò)。3己酸菌液復(fù)壯種子直接用于大生產(chǎn)種子的過(guò)程控制與意外染菌處理3.1在試驗(yàn)過(guò)程屮，將試驗(yàn)燒瓶種子與燒瓶種子進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，凡試驗(yàn)種子達(dá)標(biāo)而燒瓶種 子不達(dá)標(biāo)的總接更換種子。3.2己酸菌種了液發(fā)黑原因的分析：己酸菌種子由

9、于采用連續(xù)培養(yǎng)，感染雜菌機(jī)會(huì)較多，種子液變暗發(fā)黑則是一個(gè)征兆，接種時(shí) 必須盡是減少染菌機(jī)會(huì)，盡量避免敞口，操作注意消毒，做好無(wú)菌室紫外燈殺菌工作。化驗(yàn) 過(guò)程中取樣次數(shù)多偶爾發(fā)黑現(xiàn)彖也是基于同樣道理。對(duì)發(fā)黑種子液對(duì)采用9()°c熱處理10分 鐘的方法進(jìn)行純化，再于35°c培養(yǎng)71()天。3.3牛產(chǎn)小有時(shí)種子菌數(shù)較高，但對(duì)于己出現(xiàn)發(fā)黑跡象者，我們必須及時(shí)進(jìn)行更換，以杜 絕污染源。4 酸菌液培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)氣與牛長(zhǎng)的關(guān)系討論4.1己酸菌牛長(zhǎng)過(guò)程屮主要產(chǎn)牛氫氣及co2；4.2己酸菌培養(yǎng)產(chǎn)氣狀況與細(xì)胞數(shù)的生長(zhǎng)冇一定的相關(guān)關(guān)系，一般而言，細(xì)胞數(shù)多則產(chǎn)氣 多，細(xì)胞數(shù)少則產(chǎn)氣少。反之則不然，產(chǎn)

10、氣多未必細(xì)胞數(shù)多，因?yàn)榕囵B(yǎng)初期種子液屮有機(jī)酸 與cac03反應(yīng)產(chǎn)生c02形成假象，而產(chǎn)氣少細(xì)胞數(shù)一般都少。4.3試驗(yàn)過(guò)程中采用“ + ”、“一”來(lái)記錄產(chǎn)氣多少，“一”表示不產(chǎn)氣或基本不產(chǎn)氣，“ + ” 表示產(chǎn)生少蜃氣泡，“ + + ”表示產(chǎn)生氣泡較多或人泡小泡都有，“ + + + ”表示搖動(dòng)時(shí)氣泡 很多或不動(dòng)也冒泡。5己酸菌培養(yǎng)過(guò)程各影響因素測(cè)定5.1己酸菌接種量對(duì)己酸菌生長(zhǎng)的影響35.1.1不同接種量的牛長(zhǎng)狀況跟蹤檢測(cè)數(shù)據(jù)（單位：億個(gè)細(xì)胞/ml）接種量1天2天3天4天5天6天7天8天9天10天11天10%0. 380. 6350. 6750.81.011. 1750. 7350. 7950.

11、 7250. 530.3115%0. 3750. 831.3551.4651. 4651.611.01.041.020.810. 5820%0. 731.451.410. 8450. 351.321. 2450.511.60. 940. 575注：接種種子細(xì)胞數(shù)為1.05億個(gè)/ml。5.1.2不同接種量生長(zhǎng)llll線5.1.3不同接種量對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程的影響討論5.1.3.1從測(cè)定數(shù)據(jù)看，10%接種量在笫5、6天達(dá)高峰，15%接種量在4、5天達(dá)最高峰， 而20%接種量在第2、3天即達(dá)旺盛期；從最高細(xì)胞數(shù)看，15%及20%接種量最髙值達(dá)1.6 億個(gè)/ml,而10%接種量?jī)H為1.175億個(gè)/ml,差別較

12、人。5.1.3.2采用20%接種最其生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)多次波折，排除取樣化驗(yàn)過(guò)程的謀差，其原因難以 -時(shí)摸清，但聯(lián)系起己酸菌種子細(xì)胞數(shù)忽高忽低的現(xiàn)象，與接種量有時(shí)過(guò)人不無(wú)關(guān)系，因此, 接種時(shí)必須計(jì)量，建議采用15%接種量。5.2不同碳酸鈣對(duì)己酸菌生長(zhǎng)的影響521采用分析純碳酸鈣及工業(yè)輕質(zhì)碳酸鈣對(duì)己酸菌生長(zhǎng)的影響，釆用15%的接種量，接 入細(xì)胞數(shù)1.01億個(gè)/ml的種子，培養(yǎng)6天測(cè)得分析純caco3種子細(xì)胞數(shù)1.475億個(gè)/ml,而 加入工業(yè)輕質(zhì)caco3種了細(xì)胞數(shù)為1.375億個(gè)/ml,差別不大。5.2.2采用不同caco3對(duì)硫酸銅顯色試驗(yàn)的影響山于工業(yè)用輕質(zhì)caco3含朵質(zhì)較多，因此加入硫酸銅溶液后藍(lán)色顯得渾濁，而加入分析純 caco3種子液顯色試驗(yàn)藍(lán)色晶瑩占透澈。5.2.3取種子液lml,加入cuso4溶液2ml,乙瞇5ml充分振蕩，靜置后添加不同caco3 的藍(lán)色層顏色都較深，在7000looooppm左右。5.3不同填充系數(shù)對(duì)己酸菌生長(zhǎng)的彩響5.3.1由于己酸菌屬厭氧菌，因此盡是保持厭氧狀態(tài)。采用同為1000ml的規(guī)格有差異的燒瓶，裝入1l乙酸鈉培養(yǎng)基，加入種子液100ml,小燒瓶 液面在細(xì)頸中央，而人燒瓶液面未達(dá)到細(xì)頸，于35°c培養(yǎng)5天，測(cè)得小燒瓶己酸菌細(xì)胞數(shù) 為1.05億個(gè)/ml,而大燒瓶為0.931億個(gè)/ml,充滿培養(yǎng)棊為