1、上海交通大學(xué) 碩士學(xué)位論文四氫生物蝶吟缺乏癥的快速診斷、治療與隨訪姓名：顧梅青申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：葉軍20080401r221x突變導(dǎo)致嚴(yán)重型臨床表型。（4） bh4缺乏癥血（生物蝶吟+蝶吟） %明顯低于正常對照組（7=6.350, p=0.000）,符合診斷；1例正常人血 各蝶吟濃度的實驗批內(nèi)cv （311%）,批間cv （1923%） o 結(jié)論 （1）對所有hpa患兒及早進(jìn)行bh4缺乏癥鑒別診斷，3個月內(nèi) 治療可改善預(yù)后；（2） p87s、n52s、d96n及ivslnt-291 a>g為中國人 pts熱點突變,pcr-rflp提高基因診斷效率；（3）干血濾紙片蝶

2、吟譜分 析方法有望代替尿蝶吟譜進(jìn)行bh4缺乏癥診斷。關(guān)鍵詞四氫生物蝶吟缺乏癥，高苯丙氨酸血癥，基因突變，高效液相 色譜法the fast diagnosistreatment and follow-upof tetrahydrobiopterin deficiencyabstractobjective to emphasize the importance of differential diagnosis of bh4 deficiency in patients with hyperphenylalaninemia to acquire the gene mutation spectrum

3、 of chinese and evaluate the outcome after treatment. to make it possible that all the tests for the diagnosis of bh4 deficiency can be completed only by using dried blood spots on filter paper.method (1) fast diagnose bh4 deficiency by pterins analysis in urine, measurement of dihydropteridine acti

4、vity and bh4 loading test. (2) determine gene mutations of bh4 deficiency by means of pcr-rflp and other techniques(3) administrate bh4 and neurotransmitter precursors and evaluate therapeutic effect. (4) develop the method for pterins analysis in dried blood spots on filter paper and establish refe

5、rence values and evaluate the application perspective.results (1) 73 bh4 deficient patients, including 71 6-pyruvoyltetrahydrobiopterin synthesis deficiecy(97.26%) and 2dihydropteridine reductase deficiency(2.74%), out of 640 hpa were diagnosed and the incidence is 11.41%. (2) 18 mutation types of p

6、ts gene were identified. the p87s(40.91%)> n52s(13.64%)、d96n(11.82%) and ivs lnt-291 a>g( 10%) mutations accounted for about 76.36% of the mutant alleles. the p87l mutation was reported fdr the first time in chinese mainland. the q13x> m80t、ivs4nt-2a>g> l93m、l127f、k131n mutations were

7、 novel. the r221x mutation and two novel mutations named p172l and c104y were found in qdpr gene. (3) 96.43% of those who receive therapy within 3 months after birth have normal intellectual development. the percentage was higher than those who received delayed treatment obviously. about 89% of pts

8、gene mutations and the p172l and r221x mutations of qdpr gene were associated with severe phenotype(3) (biopterin+pterin)% in bood spots is lower than that in urin obviously( 1=6.350，p=0.000), in accordance with the diagnosis theintraassay cv was 3% 11%. the interassay cv was 19%23% conclusion (1) n

9、ecessary to make the differential diagnosis in all hpa patients as early as possible. early treatment can improve the prognosis of those who receive within 3 months after birth. (2) the p87s, n52s, d96n and i vs lnt-291a>g mutations are hotspot mutations of chinesepts gene.pcr-rflp technique can

10、increase the efficiency of gene diagnosis(3)pterins analysis in dried blood spots on filter paper instead of urine may be a practical alternative option for the differential diagnosis of bh4 deficiency.key words tetrahydrobiopterin deficiency, hyperphenylalaninemia, gene mutation, high performance l

11、iquid chromatography中英文縮略詞表bh4tetrahydrobiopterin四氫生物蝶吟hpahyperphenylalaninemia高苯丙氨酸血癥pkuphenylketonuria苯丙酮尿癥phephenylalanine苯丙氨酸pahphenylalanine hydroxylase苯丙氨酸輕化酶ptps6-pyruvoyltetrahydrobiopterin6-丙酮酰四氫蝶吟synthesis合成酶dhprdihydropteridine reductase二氫蝶睫還原酶gtpchguanosine triphosphate三磷酸鳥昔環(huán)化水解酶cyclohyd

12、rolaserflprestriction fragment length限制性片段長度多態(tài)性polymorphisml-dopalevodopa左旋多巴5-htp5-hydroxytryptophan5 羥色氨酸hplchigh performance liquid高效液相色譜分析chromatographyms/mstandem mass spectrometry串聯(lián)質(zhì)譜neo(n)neopterin新蝶吟bio(b)biopterin生物蝶吟iso(i)isoxanthopterin異黃蝶吟pte(p)pterin蝶吟pcdpterin 4a-carbinolamine蝶吟-4a-二甲醇

13、胺脫水酶dehydrogenasesrsepiapterin reductase墨蝶吟還原酶thtyrosine hydroxylase酪氨酸輕化酶tphtryptophan hydroxylase色氨酸輕化酶上海交通大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立 進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不 包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究 做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意 識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期： 年 月 日上海交通大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位

14、論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許 論文被查閱和借閱。本人授權(quán)上海交通大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或 部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制 手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密口，在 年解密后適用本授權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密口。（請在以上方框內(nèi)打“3）學(xué)位論文作者簽名：日期： 年 月 日指導(dǎo)教師簽名：日期： 年 月 日口高苯丙氨酸血癥(hpa)是最常見的常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝紊亂疾病， 可由苯丙氨酸輕化酶(pah)或輔酶四氫生物蝶吟(bh4)缺乏所致。pah缺乏癥 根據(jù)血phe濃度分為輕度

15、hpa (血phe<600|imol/l)、輕度pku (血phe 600 1200pmol/l)和經(jīng)典pku (血phe>1200|iimol/l) 1；根據(jù)血phe對bh4反應(yīng)程度分為 bh4反應(yīng)型與無反應(yīng)型兩類2o bh4是由三磷酸鳥昔(gtp)在三磷酸鳥昔壞化水解 酶(gtpch)、6-丙酮酰四氫蝶吟合成酶(ptps)和墨蝶吟還原酶(sr)的作用下合 成，作為輔助因子在參與芳香族氨基酸拜化酶即苯丙氨酸疑化酶、酪氨酸軽化酶 (th)、色氨酸輕化酶(tph)催化反應(yīng)后，bh4被氧化為蝶吟-4a-二甲醇胺，再由 蝶吟-4a-二甲醇胺脫水酶(pcd)和二氫蝶咗還原酶(dhpr)還原

16、為具有活性的bh4 (圖1)。上述任一種酶缺乏均可導(dǎo)致bh4缺乏癥。根據(jù)biodef數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(/bh4databasesbiomdb.asp)統(tǒng)計，bh4缺乏癥最常見的是ptps缺乏，約占56%,其次為dhpr缺乏，約占31%；較少見 的為gtpch缺乏和pcd缺藝各占3.7%左右。bh4缺乏不僅影響pah的活性，使苯 丙氨酸(phe)代謝障礙而在體內(nèi)蓄積，同吋又影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，如多巴胺、5-疑 色胺的合成，臨床可表現(xiàn)為不同程度的運(yùn)動障礙、肌張力異常、頑固性抽痙、肢體 震顫、智能落后等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。如僅予低/無苯丙氨酸飲食治療，血phe濃度雖能降 至正常，

17、但上述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀日趨嚴(yán)重，因此，如不能得到及時診斷、對癥治療， 其臨床癥狀比pah缺乏型更為嚴(yán)重，預(yù)后也更差。由于早期或不典型bh4缺乏癥患者 臨床難以鑒別，尤其新生兒期無特異臨床表現(xiàn)，因此需通過尿蝶吟譜分析、紅細(xì)胞 dhpr活性測定、bh4負(fù)荷試驗進(jìn)行快速的鑒別診斷，以及早明確診斷。bh4缺乏癥 患者如在出生2個月內(nèi)給予bh4、l-多巴和5-輕色胺酸的替代治療，則可避免神經(jīng)系 統(tǒng)損害的發(fā)生，改善預(yù)后。對酶相關(guān)基因突變檢測能從分子生物學(xué)角度進(jìn)-步證實 bh4缺乏癥的診斷，探討基因型與臨床表型的關(guān)系，提供適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，避免?yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害和智能發(fā)育障礙。gtpgtpch 新蝶吟三磷酸二氫新

18、蝶吟ptps6 丙酮酰四氫蝶吟生物蝶吟dhpr醍式二氫蝶吟sr酪氨酸色氨酸bh4苯丙氨酸pahthtphpcd酪氨酸l 多巴5 疑色氨酸多巴胺5 拜色胺圖1四氫生物蝶吟代謝途徑fig 1 the biochemical pathway of bh4 metabolism國外在hpa篩查、鑒別診斷、基因診斷及治療等方面起步較早。19341938 年挪威醫(yī)生發(fā)現(xiàn)了pku的發(fā)病機(jī)制及生化改變；1953年德國bickel采用低phe飲食 治療pku； 1963年美國的guthrie醫(yī)師首創(chuàng)細(xì)菌抑制法測定干濾紙片中血phe濃度， 并應(yīng)用于大規(guī)模新生兒篩查；19751976年kaufman及l(fā)eeming

19、分別報道了 ptps 缺乏癥及dhpr缺乏癥；1979年，瑞士的niederwieser等將bh4負(fù)荷試驗應(yīng)用于 hpa的鑒別診斷3, 1984年應(yīng)用hplc進(jìn)行尿蝶吟譜分析4； 1982年日本的arai等 開創(chuàng)了用干血濾紙片測定dhpr活性的方法5。在基因研究方面，編碼ptps和dhpr 的基因分別于1992年6和1987年7,8被定位，隨后相關(guān)基因突變類型逐漸被報道， 并不斷發(fā)現(xiàn)新突變。我國的新生兒hpa篩查始于1981年，近26年來全國篩查覆蓋率逐步提高。本 院內(nèi)分泌遺傳代謝病研究室于1987> 1996年分別研制成功國產(chǎn)治療pku的低/無苯 丙氨酸奶粉，1990年起在大陸地區(qū)率先

20、開展了尿蝶吟譜分析，2002年起對hpa患 兒進(jìn)行bh4負(fù)荷試驗，2003年建立干血濾紙片dhpr活性測定，完善了bh4缺乏 癥的鑒別診斷，并向全國推廣，提供bh4缺乏癥的診斷服務(wù)；近5年對門診就診的 hpa患兒常規(guī)地應(yīng)用上述方法進(jìn)行bh4缺乏癥的鑒別診斷。1995年起逐步開展了 hpa/pku的基因突變檢測、產(chǎn)前診斷等，至今已為40余例hpa家庭成功地進(jìn)行了 產(chǎn)前診斷。本課題主要研究內(nèi)容分以下三部分：第一部分：bh4缺乏癥的快速鑒別診斷及基因診斷。通過對新生兒篩查或臨床 高危篩查診斷的hpa/pku#,聯(lián)合采用尿蝶吟譜分析、血dhpr活性測定、bh4 負(fù)荷試驗進(jìn)行bh4缺乏癥的快速鑒別診斷，

21、并對確診為bh4缺乏癥患者抽提dna, 采用pcr-限制性片段長度多態(tài)性（rflp）方法快速檢測熱點突變等進(jìn)行基因篩查診 斷，了解中國人bh4缺乏癥的基因突變譜，為產(chǎn)前診斷打下基礎(chǔ)。第二部分：bh4缺乏癥的治療、隨訪。對bh4缺乏癥患兒采用bh4、神經(jīng)遞質(zhì) 前質(zhì)等治療并定期隨訪（包括-血phe濃度、體格、智能發(fā)育評價），評估臨床療效、 治療早晚與智"能發(fā)育的關(guān)系，并探討基因型與臨床表型的關(guān)系。第三部分：建立干血濾紙片蝶吟譜分析方法。建立干血濾紙片蝶吟譜檢測方法， 建立血新蝶吟、（生物蝶吟+蝶吟）及其百分比正常值，探討血、尿蝶吟譜相關(guān)性， 力爭通過干血濾紙片進(jìn)行全套bh4缺乏癥的鑒別診

22、斷（即bh4負(fù)荷試驗中血phe 濃度檢測、蝶吟譜分析、dhpr活性測定）及基因診斷，能為外省市hpa患兒提供 全套的bh4缺乏癥診斷服務(wù)。第1部分bh4缺乏癥的快速鑒別診斷及基因診斷bh4缺乏癥是由于苯丙氨酸等芳香族氨基酸輕化酶輔助因子bh4的合成或代謝 途徑中某種酶的先天性缺陷而導(dǎo)致的氨基酸代謝障礙，患兒除表現(xiàn)為hpa外，腦內(nèi) 神經(jīng)遞質(zhì)合成障礙導(dǎo)致的肌張力低下為其主要臨床特點。bh4缺乏癥早期除血phe 濃度增高外無其他特異癥狀，易被誤診為pah缺乏型hpa,低/無苯丙氨酸特殊奶粉 治療后雖能使血phe濃度下降，但仍出現(xiàn)進(jìn)行性肌張力低下等神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀， 延誤了對癥治療的最佳吋機(jī)，預(yù)后不良

23、。如今全國各省市已逐步推廣新生兒hpa篩 查，篩查診斷的hpa患兒無上述臨床癥狀，故從臨床上難以鑒別，因此對新生兒篩 查診斷或臨床高危篩查診斷的hpa患者，聯(lián)合采用尿蝶吟譜分析、血dhpr活性測 定、bh4負(fù)荷試驗，使患者在1周左右即能明確bh4缺乏癥的診斷，經(jīng)新生兒篩查 診斷的患者在出生12個月內(nèi)得到對癥治療。對確診bh4缺乏癥患者進(jìn)行快速基 因突變檢測，以從分子生物學(xué)角度證實診斷，同時得出中國人bh4缺乏癥的基因突 變譜，了解基因型與臨床表型相關(guān)性，為今后開展產(chǎn)前診斷打下基礎(chǔ)。1.1材料和方法1.1.1實驗對象自1981年至2008年2月，本院小兒內(nèi)分泌遺傳代謝病專科門診就診的來自全國29

24、個省市的1413例hpa/pku,其中經(jīng)新生兒篩查診斷430例，其余因智能發(fā)育 落后、抽痙、頭發(fā)黃就診而診斷。在家長知情同意下進(jìn)行bh4缺乏癥的鑒別診斷試 驗，并對診斷為bh4缺乏癥患者進(jìn)行基因突變檢測。1.1.2主耍儀器waters 510 plus高效液相色譜儀(hplc)美國waters公司uv-2450型雙光束分光光度計日本島津公司梅特勒delta320ph計5415r小型冷凍高速離心機(jī)ptc-220 peltier thermal cycler pcr儀alphaimager(is-2200)數(shù)字凝膠圖像系power pac3000電泳儀、電泳槽串聯(lián)質(zhì)譜儀api20001.1.3主要

25、試劑新生兒苯丙氨酸熒光測定試劑盒細(xì)胞色素c (cytc)6-甲基四氫蝶吟(6-mph4)還原型輔酶i(nadh+)生物蝶吟新蝶吟異黃蝶吟蝶吟taq dna合成酶takara la taq with gc buffergoldview核酸染料丙稀酰胺四甲基乙二胺(temed)10%過硫酸鞍(ap)tsp509邛艮制性內(nèi)切酶bbv邛艮制性內(nèi)切酶fo"限制性內(nèi)切酶其他試劑使用分析純?nèi)鹗棵诽乩?托利多公司美 國 eppendorf公 司美國mj research公司美國自然基因有限公司美國bio-rad公司美國 perkin -elmer sciexinstruments k芬蘭labsys

26、tems公司美國 sigma-aldrich 公司美國 sigma-aldrich 公司美國 sigma-aldrich 公司美國 sigma-aldrich 公司美國 sigma-aldrich 公司美國 sigma-aldrich 公司 美國 sigma-aldrich 公司美國promega公司takara生物技術(shù)有限公司北京賽百盛基因技術(shù)有限公司北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司 紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司 紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司 紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司 本研究所實驗室提供1.1.4研究方法1.1.4

27、.1 血 phe 測定血phe測定的標(biāo)本采用干血濾紙片。外周血3滴滴于干濾紙片上，每個血斑直徑 >8mm,血滴自然滲透濾紙正反兩面，自然陰干后4°c保存待檢。用打孔器打下直徑 3nmi的血片，采用熒光酶免疫法測定血phe濃度9；或血片經(jīng)卬醇萃取、鹽酸正丁醇 衍生后，用api 2000串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行血phe、酪氨酸及phe/tyr的測定10。血 phe> 120|jmol/l 者診斷為 hp a。尿蝶吟譜分析11,121）尿標(biāo)本處理新鮮尿液收集于避光容器中后，立即加入抗壞血酸（10mg/ml尿），混勻后-20°c 避光保存或滲透5x5cm專用濾紙，陰

28、干保存。用4.7mm孔徑的打孔器打下20個尿 濾紙片，加入雙蒸水lml,以層析柱13檢體過濾膜過濾，取上清液500pl,再加入 10mg mno2,離心過濾，測肌酹（cr）濃度，并以o.lmol/l hc1稀釋，使cr濃度達(dá) 23mg/dl。2）尿蝶吟譜分析hplc分析條件為：xex： 350nm,入em： 450nm, 5%甲醇為流動相，硅膠能18 碳組成的色譜柱為固定想，柱溫45°c,工作時泵壓力為100150kg/cm2,流速為 lml/mino先將各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品注入hplc內(nèi)，經(jīng)檢測器檢測，顯示出標(biāo)準(zhǔn)新蝶吟、 生物蝶吟、異黃蝶吟的峰面積。再逐個注入待測尿標(biāo)本，得出待測標(biāo)本的

29、蝶吟峰面 積，經(jīng)統(tǒng)計處理，計算出待測樣本新蝶吟（n）和生物蝶吟（b）的含量，并計算 b%b/（n+b）xl00%o3）結(jié)果判斷不同年齡健康兒童尿蝶吟譜正常值見表1。ptps缺乏時，尿新蝶吟明顯增加， 生物蝶吟明顯降低，b%多<5%或測不出；少數(shù)b%<10%； dhpr缺乏時新蝶吟可正 ?；蛏愿?，b明顯增加，b%增高或正常。表1不同年齡段兒童尿蝶吟譜正常值(mmol/mol cr)年齡新生兒26月6月10歲neopterin1.2 2.92().9 7.490.29-2.61biopterin0.42-1.921.73 3.680.35-2.67b%19.8-50.326.2 68.

30、442.7-.3紅細(xì)胞dhpr活性測定5,131) 標(biāo)本的采集和處理取末梢血2滴于s&s903濾紙上，血滴直徑8mm,通透濾紙，陰干，置4°c冰 箱保存。用打孔器從濾紙片上打下2個直徑為5mm的血片，放置eppendorf管內(nèi)， 加().15mol/l氯化鉀溶液400pl,振蕩1 osec 23次即可，然后16 ooorpm離心3min。2) 原理與方法在無酶反應(yīng)情況下的第一步反應(yīng)是6-mph4與氧化型的高鐵細(xì)胞色素c反應(yīng)， 生成醒-二氫蝶吟(q-6mph2)和還原型的亞鐵細(xì)胞色素c；在還原型煙酰胺腺卩票吟二 核昔酸(nadh)存在下，q-6mph2在dhp

31、r作用下被還原為6-mph4,后者再與高鐵 細(xì)胞色素c反應(yīng)，如此循環(huán)，亞鐵細(xì)胞色索c生成量與dhpr作用下q-6mph2被 還原為6-mph4的量成正比關(guān)系。在37°c恒溫下，用波長550 nm的雙光束實吋比 色并記錄，測得在單位時間內(nèi)產(chǎn)生亞鐵細(xì)胞色素c的nmol數(shù)，以間接地反映出 dhpr活性強(qiáng)弱程度。設(shè)置lomin內(nèi)斜率較為平穩(wěn)的一段時間中產(chǎn)生的吸光光度差 值(m),根據(jù)公式：駆相對應(yīng)的時間)x95.24x2,計算血片中每分鐘的平均dhpr 活性。每次檢測同時測定正常對照標(biāo)本，以得出待測標(biāo)本dhpr活性為正常對照活 性的百分比；定期測定陽性對照標(biāo)本以評估實驗方法的可靠性。3) 結(jié)

32、果判斷：正常人1.023.35nmol/min/5mm disc), dhpr缺乏癥患者此酶的活性 很低或測不出(圖2)。圖2正常人與dhpr缺乏癥患者dhpr活性測定曲線示意圖fig 2 the dhpr activity curve of normal control and dhpr deficient patient bh4或phe+bh4聯(lián)合負(fù)荷試驗對基礎(chǔ)血phe濃度phe>600pmol/l的患兒直接口服bh4 20mg/kg,分別于oh、2h、4h、6h、8h、24h采血測phe濃度；對已接受低(無)苯丙氨酸治療和輕度hpa 患兒，其基礎(chǔ)血phe<600

33、|limol/l者，進(jìn)行phe+bh4聯(lián)合負(fù)荷實驗，先口服phe(100mg/kg),分別于oh、lh、2h、3h采血后再進(jìn)行上述bh4負(fù)荷試驗。ptps缺 乏癥患兒在服bh4后26hlkphe濃度降至正常，dhpr缺乏癥患兒血phe濃度約 8h后下降，或無反應(yīng)。此外，對bh4缺乏癥患者與部分bh4反應(yīng)型pku、bh4無 反應(yīng)型pku其bh4負(fù)荷試驗進(jìn)行比較，以觀察各型hpa對bh4的不同反應(yīng)。棊因突變檢測1) 外周血白細(xì)胞的分離留取bh4缺乏癥患兒及部分父母靜脈血2ml,加入含6%右旋糖昔溶液(soopl) +2%乙二胺四乙酸(edta) /生理鹽水溶液(100pl)的抗凝管混

34、合，靜置lh分層， 上層液移至離心管內(nèi)于水平離心機(jī)上離心(4°c, 3 ooorpm, 5min),棄上清液，用 生理鹽水洗滌3次：加入8oo)lil雙蒸水，用吸管吹打約lmin,再加入1.8%氯化鈉 溶液800pl,離心(4°c, 3 ooorpm, 5min),棄上清液。2) 基因組dna抽提分離出的白細(xì)胞內(nèi)加入600pl白細(xì)胞裂解液，吹打均勻后加入蛋白酶k (終濃度500pg/ml)和十二烷基硫酸鈉(sds)(終濃度1%) , 37°c水溶過夜；加入等體積 的酚/氯仿抽提一次，于水相加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，混勻后 置-20°c

35、 11夜；4 5 000rpmocm5min； 70%冷乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥，加80 looplte溶液(lommol/ltris hcl, 0.1mmol/l edta, ph 8.0),測吸光度a值， 調(diào)節(jié)dna濃度至200pg/mlo -20°c保存。3) pcr反應(yīng)a. 引物設(shè)計ptps基因(pts) 6個外顯子的引物設(shè)計見表2。dhpr基因( qdpr ) 7個外 顯子的引物設(shè)計見表3。表2 pts基因外顯子引物序列、退火溫度、產(chǎn)物名稱及大小引物引物序列退火溫產(chǎn)物產(chǎn)物大名稱度()°c名稱小(bp)pts-llaf:5，-ggtggtaaggtctcatag-

36、3'54ii844r:5' -ctgtgtccgtaagttttcc-3,pts-elbf： 5'-agcaccgcagacagcgccgggaa-3'63el232r：5,-atcaggatgctggaggccgtccga-3,pts -e2bf'：59-ttctgactctccctttggtgagct-3962e2327r：5-gc attc ac actgtgtccgtaagtt3pts -e3bf：5' -gtatgttgctaacttgtgcttgg-3'55.5e3275r：5-aacactttggtagaggagaggcct

37、-3'pts -e4bf：gcacagtctctgcacattgtactg-3,56.5e4250r：ggaaccttaggagataactggttg-3'pts -e5cf：5 -t agtggcta agtg at a ag-355()e5543r：5,-tcaaacacagaaagaaac-3,注：a：擴(kuò)增部分lntronl14;b：參考引文15； c：聯(lián)合擴(kuò)增exon5和exon616；f：上游引物;下游引物表3 qdpr基因外顯子引物序列、退火溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物名稱及大小引物引物序列退火溫產(chǎn)物產(chǎn)物大名稱度()°c名稱小（bp）qdpr -e1 af；5，-cgg

38、agccgggctggc agg ag3'72el165r;5,-ccgcggagacccagcagcc-3,qdpr -e2af； 59 -ta acc a a agctgttttctcc-3958e2189r;5,-gaacatacagccagtggtc-3,qdpr -e3af；5' -agatgcttagcctgtgttg-3,54e3224r;5,-ccaatccttgtcagctgga-3,qdp r-e4bf；5，tttcctgggaatgctgagc356e4212r;5,-aagcaaccccactccacaa-3,qdpr -e5af；5'-agtg

39、gtcactgagccatct-3'53e5165r；5,-acgggaaccccaagcactt-3,qdpr -e6af；59 -cgctgaatgcgtgcttatct-3'55.8e6158r;5, -ctggaagctgctcagtcatg-3'qdpr -e7af；5-ggtcagcatgtgcccagattt356e7214r;5' -tagtgacttttctggcagg-3'注：a：參考引文17； b：參考引文18； f：上游引物；r：下游引物b. 全血pcr反應(yīng)條件50|dlpcr反應(yīng)體系（除 pts-e和 qdpr-e）:基因組dn

40、a2pldntps4pl5xpcr buffer （含mg2+）lopltaq酶0.25|nl上游引物(125pmol/pl)1.5|nl下游引物(125pmol/pl)1.5|nlddh2o30.75plpts-e 50（hl pcr反應(yīng)體系：基因組dna2pldntps4yl5xpcr buffer （含mg2+）10pl二甲亞颯dmso5pltaq酶025pl上游引物(125pmol/»l)1.5|lil下游引物(125pmol/»l)1.5|lilddh2o3o.75plqdpr -e l 50pl反應(yīng)體系:基因組dna2pldntps8|nl2xgc buffer

41、 i （含mg2+5mm）25pltakara la taq 酶0.25pl上游引物(125pmol/pl)1.5|il卜游引物（12.5pmol/|il）1.5|ilddh2o11.75pl擴(kuò)增條件：pts-e1 e4 和 qdpr -e2 e7：95 °c預(yù)變性94°c變性(溫度見表1、表2)退火72°c延伸72°c延伸ptsj1、e5：95 °c預(yù)變性94°c變性(溫度見表1、表2)退火72°c延伸5min30sec30sec 35cycles30sec5min5min40sec40sec 35cycleslmin5m

42、in72°c延伸qdpr -e l:94°c預(yù)變性lmin94°c變性30sec72°c退火兼延伸30sec35cycles72°c延伸5minc. 干血濾紙片pcr反應(yīng)用70%乙醇清潔3mm孔徑的打孔器在干凈濾紙片上打洞10點以上，然后打2 個3mm待測血片在pcr管中，加入20pl現(xiàn)配的100%甲醇和100%丙醇1:1混合液， 浸透血片；在pcr管蓋子打開狀態(tài)下置60°c烘箱1015min干燥以固定血紅素；加 入50pl0lxte緩沖液（ph&o）,經(jīng)水?。?5 20min°c、60 10min°c,重

43、復(fù)一次），4°c 過夜；取萃取液510yl作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，循環(huán)37圈。4）瓊脂糖凝膠電泳a. 配制1.8%瓊脂糖凝膠稱取2.34mg瓊脂糖粉于三角燒瓶內(nèi)，加130ml 0.5xtbe電泳緩沖液后放入微波 爐內(nèi)加熱至熔化，冷卻至約60°c時加入goldview4pl,混勻后倒入制膠模具中，凝 膠厚度一般為0.30.5cm,迅速在模具一端安插上梳子，檢查有無氣泡，待凝固。b. 電泳膠凝固后小心移去梳子并置于電泳槽中，加入0.5xtbe電泳緩沖液，讓液面高 于膠面1mm以上。pcr產(chǎn)物4pl加上適量緩沖液（0.1%混酚藍(lán)，1%sds, 3.7%edta, 50%甘油），混

44、勻后加入加樣孔內(nèi)。接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，核酸樣品 由負(fù)極向正極泳動，電壓100v,電泳1530min, pcrmaker作為分子量對照。5）ptps缺乏癥基因診斷a. pcr-rflp分析根據(jù)文獻(xiàn)報道ptps缺乏癥患者80%基因突變類型為n52s、p87s和d96n,故 對ptps缺乏癥患者首先采用pcr-rflp分析方法進(jìn)行上述熱點突變的快速篩檢。 采用tsp509 i酶對e2 pcr產(chǎn)物酶切以檢測n52s突變；采用bbv i和fok i酶對e5 pcr產(chǎn)物酶切分別檢測p87s和d96n突變。限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)10pl反應(yīng)體系:1 ox緩沖液ipl限制性內(nèi)切酶0.25plpcr

45、產(chǎn)物3plddh2o5.75|nl反應(yīng)條件:e2/tsp509 1：65 2h°ce5/bbv i及e5/fok i： 37 2hr°c65°c(page)的配制用棉球蘸丙酮將玻璃板擦拭干凈后裝配至專用支架上，取40%凝膠貯備液（29g 丙烯酰胺和lg甲叉-雙丙烯酰胺加超純水至100ml） 1ml、5xtbe各lml、ddh20 3ml 加至10ml量桶內(nèi)，混勻，加入aplopl和temed5pl,充分混勻后迅速注入玻璃 板間隙中，插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下待其凝固。 電泳凝膠充分凝固后拔出梳子，用ddh20沖洗梳孔以除去耒聚合的丙烯酰胺，將凝膠放入電

46、流槽，加alxtbe電泳緩沖液至將凝膠完全浸沒，取4»l酶切產(chǎn)物加至梳 孔內(nèi)。e2/tsp509 i酶切產(chǎn)物電泳loomin,電壓60v； e5/bbv i及e5/fok i酶切產(chǎn)物 電泳120min,電壓80vo 銀染小心取下凝膠放入裝有100ml 10%乙醇溶液的塑料容器內(nèi)，在搖床上搖5min,用ddh20洗滌3次，加入1%硝酸溶液100ml,搖5min后用（wh2o洗滌3次，加入0.2%硝酸銀溶液100ml （含75pl甲醛），搖5min后用ddh2o洗滌3次，加入3%碳 酸氫鈉溶液100ml （含75plrp醛和igl 100mg/ml硫代硫酸鈉溶液），搖至核酸條件 顯現(xiàn)，用

47、ddh20洗滌3次后用1%硝酸溶液固定5min,拍照分析。 酶切結(jié)果判斷n52s：無n52s突變的e2存在3個tsp509 i酶切位點，酶切后產(chǎn)生33bp、ll lbp、 68bp和115bp四個條帶（實際電泳后lllbp和115bp兩條帶很難分開），n52s突變 者因失去1個位點，酶切后產(chǎn)生33bp、lllbp和183bp三個條帶。p87s：無p87s突變的e5有1個bbvl酶切位點，酶切后產(chǎn)生127bp和416bp兩條帶，p87s突變者失去此位點，僅產(chǎn)生543bp條帶。d96n：無d96n突變的£5有1個卩0燈酶切位點，酶切后產(chǎn)生158bp和385bp兩條帶，d96n突變者失去此

48、位點，僅產(chǎn)生543bp條帶。b.pcr產(chǎn)物純化、測序?qū)τ每焖倜盖蟹ㄕ业缴鲜?個熱點突變的ptps缺乏癥患兒，pcr產(chǎn)物由上海棊康生物技術(shù)有限公司或上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化、測序加以證實； 對快速酶切法未能找到突變的患兒，采用pcr擴(kuò)增pts基因所有外顯子及部分內(nèi)含子1,直接測序進(jìn)行突變檢測。6）dhpr缺乏癥的基因診斷對dhpr缺乏癥患兒，pcr擴(kuò)增 qdpr 7個外顯子，pcr產(chǎn)物直接測序。7）排除多態(tài)對發(fā)現(xiàn)pts或qdpr基因新變異者，進(jìn)行反向測序，同時對父母進(jìn)行該突變的檢測以證實；另對50個正常對照者進(jìn)行相應(yīng)突變位點測序或采用rflp方法，以排 除多態(tài)性。1.1.5統(tǒng)計學(xué)分析

49、應(yīng)用spss 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件，采用廠檢驗法對bh4缺乏癥與pah缺乏型患兒之間、bh4缺乏癥三個年齡組（v3月、312月、>1歲）患兒間初診時血phe濃度進(jìn) 行差異顯著性分析，實驗數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土sd）表示，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。1.2實驗結(jié)果1.2.1 bh4缺乏癥的鑒別診斷 bh4缺乏癥的發(fā)病率及分布情況本研究室1990年逐步開展尿蝶吟譜分析等鑒別診斷，專科門診1413例hpa中 640例患者做尿蝶吟譜分析等鑒別診斷試驗，結(jié)合dhpr活性測定，診斷bh4缺乏 癥73例，bh4缺乏癥在hpa的發(fā)病率11.41% (73/640)。其中71例為p

50、tps缺乏 癥(男40例，女31例)，2例為dhpr缺乏癥(男)，分別占bh4缺乏癥的97.26 %和2.74%o 71例ptps缺乏癥患兒出生于69個無關(guān)聯(lián)的家庭，其中4個家庭中一 家2例。所有bh4缺乏癥患兒出生地分布見表4,其中2例dhpr缺乏癥患兒分別 來自江西和安徽，無血緣關(guān)系。表4 bh4缺乏癥出生地分布出生地病例數(shù)%出生地病例數(shù)%上海810.96福建79.59江蘇1114.07山東79.59浙江56.85河南22.74江西1419.18安徽68.22四川11.37廣東11.37湖北22.74湖南56.85黑龍江22.74遼寧11.37貴州11.3 血phe濃度bh

51、4缺乏癥患兒篩查或初診時的血phe濃度為715.92±413.34|nmol/l (125.4 1953pmol/l),本研究室篩查診斷的120例pah缺乏型hpa患兒篩查或初診時血phe 濃度為858.15±548.52|imol/l (124.82154ymol/l),兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(3.657, p=0.083) o <3月、312月、>1歲診斷的三組bh4缺乏癥患兒其篩查/初診吋的血 phe濃度分別為708.26±4274|nmol/l、97236±47362pmol/l、764.4±364.94|nmol/l, 差異

52、無統(tǒng)計學(xué)意義(f=2.016, p=042) o bh4缺乏癥患兒中血phe濃度v360pmol/l 占 18.03%, 3601200jnmol/l占68.85%, >1200|limol/l占 13.11 %。尿蝶吟譜分析71例ptps缺乏癥患兒尿新蝶吟濃度為(12.69±11.14)mmol/mol cr(0.38 38.7)mmol/mol cr> 生物蝶吟濃度為(0.15±0.17)mmol/mol cr(00.97 )mmol/mol cr 及生物蝶吟百分比(b%) (1.75±187)%(09.7%),有4例分別于bh4負(fù)荷

53、試驗前及后 46h留尿作蝶吟譜分析，其平均b%由服前的1.25%上升至服后的46.12%,進(jìn)一步 支持診斷。2例dhpr缺乏癥患兒的尿新蝶吟分別為2.92mmol/molcr和1 immol/molcr,生物蝶吟分別為7.44mmol/molcr和 1331mmol/molcr, b%分別為 71.79%及54.66%； 口服bh4后46 h尿b%較前明顯增高，分別為92.28%和92.43%。血dhpr活性測定ptps缺乏癥患兒的血dhpr活性為(3.44±1,22)nmol/min/5mm disc(1.2 5.83)nmol/min/5mmdisc； 2例dhpr

54、缺乏癥其血dhpr活性均為0.27nmol/min/ 5mm disc,分別為正常對照者的6.11%和7%,明顯低于正常。bh4負(fù)荷試驗結(jié)果ptps缺乏癥、dhpr缺乏癥、bh4反應(yīng)型pku(血phe濃度在口服bh4后在24 小吋內(nèi)降至基礎(chǔ)值的30%以上)及bh4無反應(yīng)型輕度pku4組患者bh4負(fù)荷試驗 顯示其血phe濃度對bh4的不同反應(yīng)(圖3)。ptps缺乏癥患兒服bh4后血phe濃 度迅速下降，2h時下降64.23%, 4h吋下降88.62%,達(dá)正常水平；2例dhpr缺乏 癥患兒的血濃度下降較慢，2h時僅下降11.79%, 4h時下降32.45%,至24h僅下降 了56.2

55、2%,未能降至正常，下降曲線與bh4反應(yīng)型pku相似；bh4無反應(yīng)型輕度 pku患兒血phe濃度無明顯變化。1000.0()900.00 l)800.001z 700.00 o1/600.00 pm 500.0() 400.00 hei&o.oo 血 roo.ooioo.(x)0.00輕度 pku(n=48)bh4 反應(yīng)性 pku(n=93)ptps 缺乏癥(n=71)dhpr缺乏癥(n=2)0246824口服bh4后時間(h)圖3各型hpa血phe濃度對bh4負(fù)荷試驗的不同反應(yīng)fig 3 reaction of defferent forms of hpa in bh4 loadin

56、g test1.2.2 bh4缺乏癥的基因診斷 ptps缺乏癥基因診斷1) ptps缺乏癥患兒基因分析情況71例ptps缺乏癥患兒中的55例(53個家系)接受了基因檢測，其中51例采用外周靜脈血抽提dna為模板進(jìn)行pts基因突變檢測，4例采用干血濾紙片淬取液為模板進(jìn)行基因突變檢測。50例患兒兩個等位基因均檢出突變，其中36例(占72%) 攜帶雜合突變，14例(占28%)攜帶純合突變；5例僅檢出一個突變基因。通過 pcr-rflp方法進(jìn)行 ms基因3個熱點突變(n52s、p87s、d96n)的快速檢測， 發(fā)現(xiàn)26例攜帶兩個熱點突變，20例攜帶一個熱點突變，分別占總檢出例數(shù)的47.27% 和 36