1、2021/8/261化學發光免疫分析化學發光免疫分析2021/8/262Contents化學發光免疫的基本概念化學發光免疫的基本概念 化學發光劑和標記技術化學發光劑和標記技術化學發光免疫分析的類型化學發光免疫分析的類型123 電化學發光免疫電化學發光免疫42021/8/263化學發光免疫的基本概念化學發光免疫的基本概念 12021/8/2641.1 1.1 化學發光的基本原理化學發光的基本原理是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態（較是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態（較低能級）躍遷到激發態（較高能級），然后再返回到基態，低能級）躍遷到激發態（較高能級），然后再返回到基態，并釋放光子的

2、過程。并釋放光子的過程。根據形成激發態分子的能量來源不同可分為根據形成激發態分子的能量來源不同可分為: :光照發光、生物發光、光照發光、生物發光、化學發光化學發光等。等。生物發光的本質是化學發光2021/8/265 某些物質在進行化學反應過程中，由于吸收了反應產生的化學能化學能而被激發，從激發態返回基態時，發射出一定波長的光，這種吸收化學能使分子發光的過程稱為化學發光化學發光(Chemiluminescence，CL) 。 1.1 1.1 化學發光的基本原理化學發光的基本原理2021/8/266化學發光分析 根據化學發光反應在某一時刻的發光強度或反應的發光總量來確定反應中相應組分含量的分析方法

3、，稱為化學發光分析。2021/8/267化學發光分析優點 化學發光具有熒光的特異性，同時不需要激發光，就避免了熒光分析中激發光雜散光的影響有很高的靈敏度， 并且不象放射分析那樣存在強烈的環境污染和健康危害，是一種非常優秀的定量分析方法。2021/8/268化學發光分析缺點 雖然化學發光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學分析本身的不特異性，制約了整個方法的使用。2021/8/269化學發光免疫分析Chemiluminescence immunoassay (CLIA)化學發光化學發光免疫學免疫學 特異性強特異性強 敏感性高敏感性高 簡便、快速簡便、快速 重復性好重復性好2021/8/26101

4、.2 1.2 化學發光的種類化學發光的種類v直接化學發光直接化學發光一些化學反應能釋放足夠的能量把參加反應的物質一些化學反應能釋放足夠的能量把參加反應的物質激發到能發射光的電子激發態，若被激發的是一激發到能發射光的電子激發態，若被激發的是一個反應產物分子，則這種反應過程叫直接化學發個反應產物分子，則這種反應過程叫直接化學發光。光。反應過程可簡單地描述如下：A + B C* + DC* C + h 12021/8/26111.2 1.2 化學發光的種類化學發光的種類v間接化學反應發光間接化學反應發光 若激發能傳遞到另一個未參加化學反應的分子若激發能傳遞到另一個未參加化學反應的分子F上，使上，使F

5、分子激發到電子激發態，分子激發到電子激發態，F分子從激發分子從激發態回到基態時發光，這種過程叫間接化學發光。態回到基態時發光，這種過程叫間接化學發光。反應過程可表示如下： A + B C* + D C* + F F* + C F* F + h 22021/8/2612化學發光效率決定于生成激發態產物分子的化學化學發光效率決定于生成激發態產物分子的化學激發效率（激發效率（CE）和激發態分子的發射效率）和激發態分子的發射效率（EM）。化學發光反應的發光效率、光輻射的）。化學發光反應的發光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發光物質的性質能量大小以及光譜范圍，完全由發光物質的性質所決定，每一個

6、發光反應都具有其特征性的化學所決定，每一個發光反應都具有其特征性的化學發光光譜和不同的化學發光效率。發光光譜和不同的化學發光效率。1.3 化學發光的效率化學發光的效率2021/8/26132021/8/2614 化學發光劑和標記技術化學發光劑和標記技術22021/8/26152.1 2.1 化學發光劑概念化學發光劑概念在化學發光反應中參與能量轉移并最終在化學發光反應中參與能量轉移并最終以發射光子的形式釋放能量的化合物，以發射光子的形式釋放能量的化合物，稱為稱為化學發光劑化學發光劑或或發光底物。發光底物。2021/8/2616 化學發光劑選擇條件：化學發光劑選擇條件：發光的量子產率高；發光的量子

7、產率高；物理物理- -化學特性要與被標記或測定的物質相匹配；化學特性要與被標記或測定的物質相匹配；能與抗原或抗體形成穩定的偶聯結合物；能與抗原或抗體形成穩定的偶聯結合物； 其化學發光常是氧化反應的結果；其化學發光常是氧化反應的結果；在所使用的濃度范圍內對生物體沒有毒性。在所使用的濃度范圍內對生物體沒有毒性。2021/8/2617直接化學發光劑直接化學發光劑 直接化學發光劑在發光免疫分析過程中不需酶的催直接化學發光劑在發光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發光反應，它們在化學結構上有化作用，直接參與發光反應，它們在化學結構上有產生發光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。產生發光的特有基團，可

8、直接標記抗原或抗體。 2.2 2.2 化學發光劑種類化學發光劑種類直接化學發光劑，間接化學發光劑直接化學發光劑，間接化學發光劑2021/8/2618 A. . 吖啶酯吖啶酯 在堿性條件下被在堿性條件下被H2O2氧化時氧化時,發出發出波長為波長為470nm的光，具有很高的發光效率，其激的光，具有很高的發光效率，其激發態產物發態產物N-甲基吖啶酮是該發光反應體系的發光體。甲基吖啶酮是該發光反應體系的發光體。 2021/8/2619 代表性物質：光澤精代表性物質：光澤精 (lucigenin)NCH3NCH3+.2NO3-OxidationOH -NOCH3*NMA+LIGHTLucigeninN-

9、METHYLACRIDONE (NMA)氧化劑：H2O2還原劑：乳酸 尿酸 抗壞血酸催化劑：過渡金屬離子、酶抑制劑：酚類物質對此反應有抑制作用間接測定：能夠生成H2O2的基質及相應的酶max = 445 nm量子產率高，易于標記，量子產率高，易于標記，是發展化學發光免疫分析是發展化學發光免疫分析和和DNA發光探針的重要標發光探針的重要標記物記物2021/8/2620B.B.三聯吡啶釕三聯吡啶釕 三聯吡啶釕三聯吡啶釕 RU(bpy)32+是電化學是電化學發光劑，它和電子供體三丙胺（發光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面）在陽電極表面可同時失去一個電子而發生氧化反應。可同時失去一個電子而

10、發生氧化反應。 三聯吡啶釕三聯吡啶釕2021/8/2621酶促反應發光劑：酶促反應發光劑：利用標記酶的催化作用，使發光劑（底物）發光，這利用標記酶的催化作用，使發光劑（底物）發光，這一類需酶催化后發光的發光劑稱為酶促反應發光劑。一類需酶催化后發光的發光劑稱為酶促反應發光劑。 A魯米諾及其衍生物魯米諾及其衍生物 BAMPPD間接化學發光劑間接化學發光劑2021/8/2622A.A.魯米諾及其衍生物魯米諾及其衍生物 魯米諾發光原理魯米諾發光原理2021/8/2623BAMPPD3-(23-(2- -螺旋金剛烷螺旋金剛烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“- -磷酰氧基磷酰氧基) )苯

11、苯-1,2-1,2-二氧雜環丁烷二氧雜環丁烷2021/8/2624A. A. 碳二亞胺（碳二亞胺（EDCEDC）縮合法）縮合法 2.3 2.3 發光劑的標記發光劑的標記2021/8/2625B. B. 過碘酸鈉氧化法過碘酸鈉氧化法 2021/8/2626C C重氮鹽偶聯法重氮鹽偶聯法 2021/8/2627D. N-D. N-羥基琥珀酰亞胺活化法羥基琥珀酰亞胺活化法 2021/8/2628 1 1發光劑的選擇發光劑的選擇 2 2被標記蛋白質的性質被標記蛋白質的性質 3 3標記方法的選擇標記方法的選擇 4 4原料比原料比 5 5標記率標記率 6 6溫度溫度 2.4 2.4 影響發光劑的標記的因素

12、影響發光劑的標記的因素2021/8/2629化學發光免疫分析的類型化學發光免疫分析的類型32021/8/2630p用化學發光劑（吖啶酯或魯米諾類）直接標記抗體用化學發光劑（吖啶酯或魯米諾類）直接標記抗體(抗原抗原)，與待測標本中相應的抗原，與待測標本中相應的抗原(抗體抗體)發生免疫反應發生免疫反應后，形成固相包被抗體后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-化學發光劑標記抗體化學發光劑標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和）和NaOH使成使成堿性環境，化學發光劑在不需要催化劑的情況下分解、堿性環境，化學發光劑在不需要催化劑的情況下分解、發光發光 。p由集光器

13、和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。3.1 3.1 直接化學發光免疫分析直接化學發光免疫分析2021/8/2631發光發光Y YY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶吖啶酯標帶吖啶酯標記物抗體記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化學發光的機理（夾心法）直接化學發光的機理（夾心法）2021/8/2632 化學發光酶免疫

14、分析（化學發光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發光反應的酶）是用參與催化某一化學發光反應的酶如辣根過氧化物酶（如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原體，在與待測標本中相應的抗原(抗體抗體)發生免疫反應后，形成固發生免疫反應后，形成固相包被抗體相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶標記抗體復合物，酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物經洗滌后，加入底物(發光劑發光劑)，酶催化和分解底物發光，由光量子閱讀系統接收，光，酶催化和分解底物發光，由

15、光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變為電信號并加以放大，再把它們傳送至電倍增管將光信號轉變為電信號并加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。3.2 3.2 化學發光酶免疫分析化學發光酶免疫分析2021/8/2633該分析系統采用辣根過氧化物酶（該分析系統采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體）標記抗體(或抗原或抗原)，在與反應體系中的待測標本和固相載體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被抗體發生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發光劑、）標記

16、抗體復合物，這時加入魯米諾發光劑、H2O2和化學發光增強劑使產生化學發光。和化學發光增強劑使產生化學發光。3.2.1 辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析2021/8/2634辣根過氧化物酶標記化學發光免疫分析示意圖辣根過氧化物酶標記化學發光免疫分析示意圖 3.2.1 辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析2021/8/2635該分析系統以堿性磷酸酶該分析系統以堿性磷酸酶 標記抗體標記抗體(或抗原或抗原)，在與，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被抗體形

17、成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶標記抗體復合物，酶標記抗體復合物，這時加入這時加入AMPPD發光劑，堿性磷酸酶使發光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫脫去磷酸根基團而發光。去磷酸根基團而發光。 3.2.2 堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析2021/8/2636堿性磷酸酶標記化學發光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標記化學發光免疫分析示意圖 3.2.2 堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析2021/8/2637分配樣品分配樣品, ,磁顆粒磁顆粒和試劑和試劑孵育，使反孵育，使反應物結合應物結合在磁場中清在磁場中清洗去除未結洗去除未結合物質合物質加入

18、底物加入底物產生信號產生信號孵育孵育, ,促使促使信號的產生信號的產生信號信號檢測檢測2021/8/2638 電化學發光免疫電化學發光免疫4Flow cellFeOxidizedReduced2021/8/2639Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA20世紀80年代出現，90年代用于臨床檢測。ECLIA電化學電化學免疫學免疫學化學發光化學發光發光特點：發光特點：聯吡啶釕（標記物+三丙胺自由基（催化）+三角形脈沖電壓（激發），0.01ms0.01ms就就可發出穩定的光可發出穩定的光。優點：優點：1. 靈敏度高（聯吡啶釕再循環），2.檢測步驟簡化（

19、游離/結合）3.可實現多元檢測 4.可實現自動化2021/8/2640 在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，用電化學發光劑三聯吡啶釕Ru(bpy)32+標記Ab，通過Ag-Ab反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極上發出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。電化學發光免疫分析電化學發光免疫分析 Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA原理原理電化學發光、免疫分析檢測、生物素電化學發光、免疫分析檢測、生物素-抗生素、固相磁抗生素、固相磁珠技術珠技術2021/8/2641電化學發光劑 定義：指通過在電極表面進行電化學反應而發出光的物質。

20、特點 反應在電極進行 化學發光劑：三聯毗啶釕 電子供體為：三丙胺（TPA）NNNNNNRuOONOO2021/8/2642 ECL分析中采用Ru(bpy)32+作為標記物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羥基琥珀酸胺酯（NHS） ，該衍生物具有水溶性，且高度穩定，保證電化學發光反應的高效和穩定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯吡啶釕 Ru(bpy)32+ 特點2021/8/2643 Ru(bpy)32+衍生物與免疫球蛋白結合的分子比超過20仍不會影響抗體的可溶性和免疫活性； Ru(bpy)32+分子量小，空間位阻小 ，即便小分子的核酸也能標記，使檢測的樣品種類大大豐富，更重要的是為其檢測樣品

21、種類的開發前景提供了廣闊空間。三聯吡啶釕 Ru(bpy)32+ 特點2021/8/26441電化學反應2化學發光3循環+ECLIA ECLIA 原理原理2021/8/2645常用方法類型常用方法類型 固相磁性微球吸附 采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特點是反應面積比板式擴大2030倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應時類似液相，反應速度大大加快； 鏈霉親和素-生物素吸附 “鏈霉親和素-生物素”是是具有很強的非共價相互作用的一對化合物，具有牢固而特異的結合，應用此放大系統，使檢測的靈敏度大大提高親和素糖蛋白；生物素-維生素H2021/8/2646ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）2021/8/2647ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結合）2021/8/264