1、材料準(zhǔn)備：幼苗培養(yǎng)時選取飽滿的種子,經(jīng)過10%次氯酸鈉消毒后,于30恒溫催芽3天,之后選取長勢一致的種子播于96孔PVP板中,并置于盆中(長24cmX寬24cmX高10cm)。在RXZ-500C人工氣候箱中進行幼苗培養(yǎng)。培養(yǎng)前1周放入水中培養(yǎng),于第3周時置于木村B半營養(yǎng)中,于第4周時放入木村B全營養(yǎng)液中,將生長4周的幼苗置于20%PEG-6000中模擬干旱脅迫,分別處理5 h、24 h、72 h,以不進行干旱脅迫營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對照(CK)。為防止根系缺氧,用加氧設(shè)備定期加氧。人工氣候箱白天溫度設(shè)定為29°C,夜間設(shè)定為27°C,14 h光照/12 h黑暗,光強為2200

2、01x。脅迫結(jié)束后馬上取樣,取幼苗所有葉片和根,用銀箔紙包好,放入液氮中迅速冷凍,然后保存于-80°C超低溫冰箱中儲存,用子生理指標(biāo)的測定。試驗設(shè)置3次重復(fù),取樣時每個品種取一盤,每20株為一次重復(fù)。酶類物質(zhì)和非酶類物質(zhì)1、抗氧化酶活性測定酶液提取:取樣品0.25 g于冰研缽中,加入5 ml預(yù)冷的0.05mol/L 磷酸緩沖液(pH7.8)(內(nèi)含5mmol/LEDTA,2 mmol/L抗壞血酸,2%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨成漿,在4°C 10000 g下離心30分鐘,上清液用于超SOD、POD、CAT和APX活性測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定:釆用氮藍四唑法(Dh

3、indsa等,1981)。在微燒杯中依次加入1.5 ml, 0.05mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.8), 0.3 ml 130mmol/l甲硫氨酸(Met), 0.3ml,750umol/L 氮藍四唑(NBT), 0.3 ml 100umol/LEDTA-Na2, 0.3 ml 20umol/L核黃素,0.05 ml酶提取液,0.25 ml蒸餾水,反應(yīng)體積共3 ml。在60 umol photonsm-2s-1的日光等下反應(yīng)20min,同時在暗中和光下分別做2個對照。以暗對照調(diào)零,在560nm下測定吸光度,以抑制NBT還原的50%為一個酶活單位計算SOD活性。過氧化物酶(POD)活性測定:

4、采用愈創(chuàng)木酌法(李合生,2000)。向比色杯中加入0.1 ml酶提取液,然后2.6 ml 0.3%愈創(chuàng)木酚，用0.3 mlO.6% H2O2啟動反應(yīng),在470 nm下測定連續(xù)3分鐘內(nèi)吸光度的變化,用每分鐘每克樣品鮮重的吸光度的增加值表示酶活性。過氧化氫酶(CAT)活性測定:參照部琦(2000)的方法,用蒸餾水調(diào)零。向比色杯中加入0.2 ml酶提取液,再加入2.8ml0.06mol/LH202啟動反應(yīng),立即測定240 nm下連續(xù)3分鐘內(nèi)吸光值的變化,用每分鐘每克樣品鮮重的吸光度的降低值表示酶活性。抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定:參照Nakano和Asada (1981)的方法,用蒸懷水調(diào)零

5、。向比色杯中加入0.2 ml酶提取液,1.75ml0.05mol/L磷酸緩沖液(PH7.0),0.3 ml 1mmol/L EDTA,0.3 ml mmol/L抗壞血酸,0.3 ml蒸餾水,用0.3 ml 1 mmol/LH202啟動反應(yīng),立即測定290 nm下連續(xù)1分鐘內(nèi)吸光值的變化,用每分鐘每克樣品鮮重的吸光度的降低值表示酶活性。谷骯甘肽還原酶(GR)活性測定:照KnSrzer等(1996)的方法,取葉片0.3 g于冰凍研缽中,力口5 ml預(yù)冷的100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,內(nèi)含1 mmol/L EDTA),在冰浴上研磨成勻漿,4°C 12 000 g下離心30分鐘,

6、上清液即為酶提取液。在比色杯中加入0.2 mL酶提取液,3 ml碟酸緩沖液(pH7.5,含 1 mmol/L EDTA),0.1 ml 5 mmol/L 還原型谷胱甘肽(GSSG),最后用0.03 ml 3 mmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核昔酸磷酸(NADPH)啟動反應(yīng),在340 nm下測定連續(xù)3分鐘內(nèi)吸光度的變化,用每分鐘每克樣品鮮重的吸光度的降低值表示酶活性。脫氧抗壞血酸還原酶(DHAR)活性測定:照Doulis等(1997)的方法,取葉片和根0.2 g于冰凍研缽中,加預(yù)冷的提取液(憐酸鉀緩沖液Ph7.5,內(nèi)含ImM乙二胺四乙酸EDTA,0.1 mM聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-1

7、00,2%聚乙稀吡咯烷酮PVP) 5 ml,在冰浴上研磨成勻漿,4。C 12000 g離心20分鐘,上清液即為酶提取液。在比色皿中加入0.2 ml酶提取液,2 ml磷酸鉀緩沖液(pH7.O),0.3 ml 25 mmol/L還原型谷耽甘肽(GSH),0.3 ml 1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),加入 0.1 ml2 mmol/L脫氧抗壞血酸DHA)啟動反應(yīng),在265nm下測定連續(xù)3分鐘內(nèi)吸光度的變化,用每分鐘每克樣品鮮重的吸光度的降低值表示酶活性。2抗壞血酸和谷胱甘肽含量測定抗氧化劑還原型抗壞血酸(AsA)和還原型谷胱甘肽(GSH)及其氧化產(chǎn)物氧化型抗壞血酸(DHA)和氧化型谷耽甘肽(

8、GSSG)的含量釆用李忠光等(2003)的方法測定。抗壞血酸和谷胱甘肽的提取:稱取樣品0.25 g,加入預(yù)冷的5%橫基水楊酸2.5 ml,充分冰預(yù)研磨,于4°C下20000g離心20分鐘,將上清液分裝,進行抗氧化劑含量測定。還原型抗壞血酸(ASA)和氧化型抗壞血酸(DHA)含量測定:取100 uL上清液,加入24uL 1.84 mol/L三乙醇胺以中和樣液,加入250 uL 50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,內(nèi)含 2.5 mmol/L EDTA),加入 50uL10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT), 25°C保溫 10 分鐘,使DHA還原為AsA,加入0.5%乙基馬

9、來酰亞胺50ul,混勻,以除去剩余的DTT,此時分別加入10%TCA,44%磷酸,4%2,2-雙吡啶(用70%乙醇配制),各200 ul,混勾,加入3% FeCl3 lOOul,混勻,4°C水浴60分鐘,到時在525 nm處測出吸光度。此法用來測定樣品中總抗壞血酸(AsA+DHA)的含量。在AsA的測定中,把上述的DTT和乙基馬來酰亞胺用等體積的蒸館水替代即可。以5%磺基水楊酸為溶劑,用同樣的方法制作AsA標(biāo)準(zhǔn)曲線。DHA含量為每個樣品的總抗壞血酸含量與AsA含量的差值。還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量測定:取50ul上清液,加入5%磺基水楊酸50 ul,然后

10、加入24 ul 1.84mol/L三乙醇胺以中和樣液,加入50ul,10%乙稀吡啶(用70%乙醇配制),25°C水浴60分鐘,以除去GSH,到時加入706ul 50mmol/L憐酸緩沖液(pH 7.5,內(nèi)含 2.5 mmol/L EDTA),加入 20ul 10 mmol/L還原型煙醜胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和80 ul 12.5 mmol/L 二硫硝基苯甲酸(DTNB),混勻,25°C保溫10分鐘,到時加入20ul 50 U/ml谷胱甘肽還原酶(GR),總體積為1 ml,立即混勻,讀出3分鐘時的吸光度。此法用來測定GSSG含量,總谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量

11、的測定,把上述的乙烯P比唆用等體積的蒸懷水替代即可。以5%橫基水楊酸為溶劑,用同樣的方法制作GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線。GSH的含量為每個樣品的總谷胱甘肽與GSSG含量的差值。脯氨酸含量測定釆用郝建軍(2001)的方法進行測定。取樣品0.5 g,剪碎后放入具塞試管中,加入5 ml 3%的磺基水楊酸溶液,沸水浴提取10分鐘。冷卻后吸取上清液2 ml,加入2 ml蒸館水、2 ml冰醋酸及4 ml酸性節(jié)三酮,充分搖勻,沸水浴中加熱30分鐘。冷卻至室溫,加入4 ml甲苯,充分搖勻,以萃取紅色產(chǎn)物。靜置分層后,吸取上層甲苯,取上層甲苯于520nm下測定吸光度,根據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸溶液所作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品中脯氨酸含量

12、。脯氨酸含量(ug/g)=(標(biāo)準(zhǔn)曲線査得脯氨酸含量(ug)x提取液體積)/(樣品重X測定液體積)丙二醛含量測定丙二酸含量測定參照Heath和Packer (1968)方法。取0.5g樣品,加入3 ml 0.1%(w/v)三氯乙酸(TCA)溶液,研磨成勾楽,15000 g離心20分鐘,取上清液1 ml加入4 ml 20% TCA (內(nèi)含0.5% (w/v)硫代巴比妥酸(TBA),于100°C水浴煮沸30分鐘,冷卻后10000 g離心10分鐘,取上清液測定532 nm和600 nm波長下的吸光度。丙二醛含量(umol/g)=<(OD532 -0D600)x反應(yīng)液體積X提取液體積&g

13、t;/(0.155 X樣品重量X測定用提取液體積)0.155 為丙二醛的消光系數(shù)(umol/ml)。超氧陰離子含量測定超氧陰離子產(chǎn)生速率參照Elstner和Heupel (1976)的方法測定。取樣品0.5 g,加入3 ml 65 mmol/L(pH7.8)磷酸緩沖液,冰浴研磨,4°C下5000 g離心10分鐘。取上清液 0.75 毫升,加入 0.675 ml 65 mmol/L(pH7.8)磷酸緩沖液和 0.07 ml lOmmol/L鹽酸經(jīng)胺,搖勻,25°C水浴保溫20分鐘,然后加入17mmol/L磺胺0.375ml,搖勻,再加入7mmol/L a-萘胺0.375ml,

14、搖勻,25°C水浴20分鐘,加入等體積(2.25 ml)色素萃取液三氯甲烷,取粉紅色水相(上層)測定530nm的吸光度,以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算超氧陰離子(O2-)產(chǎn)生速率。可溶性糖含量的測定:可溶性糖含量的測定參照李合生方法進行測定,取0.10 g材料,加入10 ml蒸饋水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30 min (提取2次),提取液過濾入25 ml容量瓶中,反復(fù)漂洗試管及殘渣,定容至刻度。取0.5 ml提取液,加入0.5 ml蔥酮和5 ml濃硫酸,充分震蕩,立即將試管放入沸水浴中,逐管準(zhǔn)確保溫1 min,取出后自然冷卻至室溫,以空白作參比,測定630mn波長下吸光度。可溶性糖含量=（從回歸方程求得糖的量/吸取樣品液的體積）*提取液量*稀釋倍數(shù)/（樣品鮮重*106）*100%可溶性蛋白含量的測定:可溶性蛋白含量的測定參照李合生方法進行,取鮮樣0.5 g,用5 ml蒸館水研磨成勻架后,10000 r/min離心20 min,取上清液1.0 ml于試管中,加入5 ml考馬斯亮藍G-250溶液,充分混合,放置5 min后在595 nm下比色,測定吸光度,并通過