1、摘要它是從自然中分離出新的有用的微生物越來越難使用基于純培養技術的常規篩查方法的環境. 提出了一種與昆蟲共生菌的篩選方法. 該方法包括以下兩個步驟。在第一步中，所需的微生物生長良好的降解難降解昆蟲腸道中材料的存在是利用昆蟲的生存能力作為一項指標檢測. 第二步，所需的微生物均選自生存的昆蟲. 第二步是基于一個想法，昆蟲的內臟作為連續培養系統，微生物不能降解的飲食成分被淘汰而那些可以降低膳食成分的保留和繁殖在腸道。家白蟻喂人工飼料含苯酚為木質素衍生物和難降解的復合模型。每個C.白蟻取食人工飼料含100 mg/L苯酚具有適應不同層次的苯酚的毒性。20% C。白蟻喂人工飼料含100 mg/L苯酚在幾天

2、內死亡而其他人存活超過10 d。結構的腸道微生物的生存C.白蟻喂食100毫克/ L酚人工飼料逐漸變為，從木材喂養C.白蟻利用人工培養基苯酚作為唯一碳源的富集培養得到的細菌群落非常不同。此外，只有三的物種（如DGGE帶）是從木材喂養C.白蟻腸道中檢測到，而200倍以上的苯酚降解菌在C.白蟻取食人工飼料的腸道檢測苯酚。在這九種（如DGGE帶）苯酚降解菌的分離。本研究建立的篩選方法也可以應用于各種昆蟲，導致各種微生物能夠降解難降解化合物的分離。（DGGE是根據DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。具體而言，就是將特定的雙鏈

3、DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨著電泳的進行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當它到達其變性要求的最低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態，這就導致其遷移速率變慢，由于這種變性具有序列特異性，因此DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開，它是一種很有用分子標記方法?，F已廣泛應用于生物多樣性調查、親緣關系鑒定、基因突變檢測等多個領域。）雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA 片段能夠被區分開，但同樣長度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區分。DGGE/TGGE 技術在一般的聚丙烯酰胺

4、凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區分開來。一個特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區域(meltingdomain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個幾百個堿基對的DNA 片段一般有幾個解鏈區域，每個解鏈區域有一段連續的堿基對組成（圖1）。當變性劑濃度逐漸增加達到其最低的解鏈區域濃度時，該區域這一段連續的堿基對發生解鏈。當濃度度再升高依次達到各其他解鏈區域濃度時，這些區域也依次發生解鏈。直到變性劑濃度達到最高的解鏈區域濃度后，最高的解鏈區域也發生解鏈，從而雙鏈DNA 完全解鏈。2不同的雙

5、鏈DNA 片段不同的雙鏈DNA 片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區域及各解鏈區域的解鏈濃度也是不一樣的。當它們進行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區域解鏈，此時DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而，一旦變性劑濃度達到DNA 片段最高的解鏈區域溫度時，DNA 片段會完全解鏈，成為單鏈DNA 分子，此時它們又能在膠中繼續遷移。因此如果不同DNA 片段的序列差異發生在最高的解鏈區域時，這些片段就不能被區分開來。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個堿基對）可以解決這個問題。含有GC 夾子的DN

6、A 片段最高的解鏈區域在GC 夾子這一段序列處，它的解鏈濃度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當加了GC 夾子后，DNA 片段中基本上每個堿基處的序列差異都能被區分開。然而一旦DNA 片段遷移到一特定位置，其變性劑濃度剛好能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區域解鏈時，雙鏈DNA 片段最低的解鏈區域立即發生解鏈。部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的DNA 片段會在膠中不同位置處達到各自最低解鏈區域的解鏈濃度，因此它們會在膠中的不同位置處發生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在膠中被區分開來。3特點DGGE/TGGE已廣泛用于分析自然環境中細菌

7、、藍細菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性8。這一技術能夠提供群落中優勢種類信息并同時分析多個樣品，具有可重復和操作簡單等特點, 適合于調查種群的時空變化, 并且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。DGGE和TGGE分別通過逐漸增加的化學變性劑線性濃度梯度和線性溫度梯度可以把長度相同但只有一個堿基不同的DNA片段分離。DNA分子的雙鏈在特定溫度下會分離，這個溫度取決于互補鏈的氫鍵含量（富含GC的區域融解溫度較高）和相鄰堿基的引力。DGGE 法的優缺點優點1、幾乎可以檢出所有突變2、可將突變分子完好無損地同野生型分子分開用于進一步的分析3、無須標記4、電

8、泳前只需一步操作5、可用于未經擴增的基因組 DNA6、可檢測出象甲基化這樣的 DNA 修飾缺點1、需要專門設備需要用計算機對序列進行分析2、需要進行預實驗需要昂貴的“ GC 夾板”3、無法確定突變在 DNA 片段中位置4、需要用含有毒性物質甲酰胺的梯度凝膠5、DNA 片段大小限制在 100-500bp在第十九和第二十世紀，用純培養技術分離了許多有益微生物，這對工業微生物的快速發展。然而，它是用純培養技術分離出新的微生物越來越難。這已經限制了微生物的進步。各種分子生物學技術揭示，存在自然界中99%微生物的不能在純培養分離和保存。為了解決這個問題，新的篩選方法的發展是非常重要的。我們一直專注于開發

9、一種新的共生與分離微生物新的方法。在自然生態系統，大多數微生物存在的維護與其他生物的關系。這樣的例子包括白蟻腸道微生物的共生關系、豆類根瘤菌共生和地衣共生?？梢蚤_發一個有效的利用共生體之間所需的微生物篩選方法微生物和其他生物。眾所周知，腸道微生物在昆蟲的飲食成分的降解中起著重要的作用。微生物降解的產品不斷去除通過吸附在腸壁或排泄通過肛門。這樣，昆蟲的腸道可以比作一個連續培養系統，微生物生長速率低（那些不能利用飲食成分）是淘汰，而高增長率的微生物（那些能夠有效地利用飲食成分）被保留，成為腸道優勢種群。我們一直在研究昆蟲和腸道微生物之間的共生關系，這是由他們的飲食（飲食昆蟲介導腸微生物群落），使用

10、家白蟻作為模式生物。在這些研究中，C.白蟻是喂人工飼料和響應的飲食成分的變化在腸道微生物的變化進行監測。我們的初步結果表明，當C.白蟻飲食成分（木取食的昆蟲）是從木材變成了葡萄糖，其腸道微生物逐漸從木材降解葡萄糖的降解微生物，最后，他們失去了他們的木材降解能力。這一結果表明，如果昆蟲飲食成分改變，腸在昆蟲的改變微生物群落，能夠降解的飲食成分成為優勢物種的微生物。換句話說，微生物能夠降解難降解化合物可以在昆蟲的生存與含有降解化合物為唯一碳源的困難的人工飼料飼養昆蟲腸道繁殖?？捎糜诜蛛x所需的微生物（飲食成分降解微生物）通過控制昆蟲的飲食成分。C.白蟻喂人工飼料含酚的化合物作為模型很難降解。在喂養，

11、大約20%的白蟻死亡但一些幸存下來。在幸存的C.白蟻腸道中的微生物群落變化的微觀觀察和采用PCR-變性梯度凝膠電泳分析（pcrdgge）方法。隨后，苯酚降解微生物的篩選使用瓊脂培養基和膜過濾的方法進行。此外，菌落數 形成的膜過濾器計數和物種多樣性是用洗版液分析（PW）PCRDGGE方法（6）。從這些實驗中，結果顯示 許多種苯酚降解菌的分離篩選方法可以使用這個。該方法可用于各種有效的篩選難降解的比較。材料方法白蟻 工人階級是從實驗室收集白蟻C.白蟻保持在實驗室菌落創新人類宜居，可持續研究所圈，京都大學，日本。他們保持從日本紅松木片（赤松）在30±2°C.人工飼料和飼養試驗的制

12、備人工飼料的配制是根據執行Tanaka等人描述的方法。（5）。瓊脂糖（15 g/L）（Takara聯合，OTSU）溶解在蒸餾水和蒸壓在121°C 15分鐘。苯酚（50 g/L）是由經過消毒0.22m微孔過濾器（微孔，貝德福德，MA，USA）和用消毒的瓊脂糖溶液混合得到各種酚濃度（50，100，150和200毫克/升）。解決方案是在無菌培養皿凝固。作為對照，人工飼料含15 g/L瓊脂糖，或15 g/L瓊脂糖和赤松木粉（小于100m）的制備。瓊脂糖凝膠凝固后切成塊（一塊無菌= 25×25×5毫米）。工人階級的白蟻（25個）和人工飼料的一塊被放在一個無菌的聚苯乙烯 例（

13、30×30×10毫米），并在30°C孵育。作為一個饑餓狀態，C.白蟻個體被放在一個消毒聚苯乙烯箱潮濕的條件下（如是放在一個無菌的玻璃培養皿充分滅菌蒸餾水）。在孵化過程中，可行的白蟻數定期和他們的生存率計算。生存比代表存活數目C.白蟻作為初始數量的百分比（25白蟻）。C.白蟻的重量也進行了測量。十C.白蟻個體隨機選擇和加權對化學平衡，和他們的平均權重計算。所有的實驗都進行三次。觀察原生動物和細菌計數不同品種的C.白蟻腸道原蟲進行顯微觀察和計數周期。三工蟻飼喂任何飲食和隨機采集。他們完全是從后部拉出，切碎用細鉗片。后腸內容然后暫停在30l載體U解（7）。后腸片浸軟輕輕

14、在解決促進原生動物的釋放。利用光學顯微鏡鑒定不同種類的原生動物。一些原生動物采用血球計數每個物種（kayagaki irikakogyo，東京）。細菌數量也使用細菌計數（kayagaki irikakogyo）。在瓊脂平板上培養的腸道微生物腸道微生物培養在瓊脂平板上對苯酚降解菌分離C.白蟻腸道喂養后，各種飼料10 d昆蟲后腸被從后部用細鉗拔出。后腸勻漿用顆?；旌显?毫升500中含有500毫克/升苯酚（8）。腸道勻漿（100L）與9001 500稀釋介質。這個過程重復了幾次，制備所需濃度腸道勻漿。稀釋腸道勻漿涂抹一種含500 500瓊脂平板1.5%瓊脂凝膠中，并在30°C 10 d后孵

15、化培養，菌落形成的500瓊脂平板計數，和集落形成單位（CFU /腸腸）計算。所有的實驗都進行三次。采用膜過濾的方法對腸道微生物的培養當培養在瓊脂板上進行，據觀察，在瓊脂一些雜質影響結果。微生物不能降解苯酚但耐500mg/L的苯酚形成的殖民地。腸道微生物因此耕地采用濾膜法測定苯酚降解菌只。該系統含有苯酚為唯一碳源。按照上述方法制備的是腸組織勻漿。一個milliflex過濾漏斗裝置，hvwp 0.45M（微孔），成立一個吸泵。的500介質（5毫升）最初被倒入漏斗，和腸道勻漿100L放入漏斗中均勻地混合與500。液體餾分被過濾出來，腸道微生物膜過濾器上收集的。膜過濾是在液體介質盒，mxlmc0120

16、（微孔）充滿了500中，孵育在30°C 10 d后孵化，菌落形成的膜過濾器進行計數，并計算CFU /腸。所有的實驗都進行三次。計算使用EQ是生物體對苯酚降解細菌總數的比例。Ratio = CFU/gut (membrane filter method)/Total number of bacteria對微生物降解苯酚的能力測定微生物形成的菌落，在液體培養培養確定自己的苯酚降解能力。殖民地是挑一個牙簽接種到500中5毫升在L形的試管（泰銘，埼玉縣），孵育一振動篩（30°C，30次/分鐘）27 d后孵化，這采用在培養液中苯酚濃度為酚試驗和光（光，大阪），和微生物降解苯酚苯酚降解

17、菌的鑒定。富集培養木喂養C.白蟻膽量（五個）被從后部使用一雙好的鉗和懸浮在MP500培養基中5毫升。腸懸液倒入一個L形的試管（泰銘）和30°C和30轉/分鐘。細胞生長培養用分光光度計定期測量20A（島津）。采用苯酚濃度在文化酚試驗和光（光）。當苯酚的培養液中是復雜的。當苯酚文化肉湯完全消耗,微生物在文化收集通過離心(10000×g,5分鐘。PCR-DGGE analysis在C.白蟻喂食人工飼料的腸道微生物的組成變化采用PCR-DGGE方法分析。上述分析是基于C.白蟻喂食有瓊脂糖人工飼料進行，酚人工飼料或木10 d。十個C.白蟻個體隨機抽取每一組，他們完全用一雙細鉗從他們的

18、后部取出后場。使后腸均勻使用快速DNA提取試劑盒（生物101，Vista，CA，USA），和腸道微生物總DNA的提取。該細菌的16S rDNA V3區進行擴增357f-gc（5- cgcccgccgcgcgcgggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3）和譜（5- gtattaccgcggctgctgg-3）作為PCR引物。每個擴增反應混合物（20L）由0.5 U Ex Taq DNA聚合酶（Takara Shuzo），總DNA溶液1l，10×PCR緩沖液（buffer）2L， 0.25m每條引物，和混合物含有100m脫氧核苷三磷酸。著陸程序（

19、9，10）實施如下：在最初的94°C變性5分鐘，30個循環94°C 1 min和72°C 1分鐘進行，然后將反應混合物保持在72°C 7分鐘。在反應循環中，退火溫度降低了1°C從 65°C 到56°C在前20次循環中每兩個循環方法 將常規PCR與半套式PCR及隨機引物擴增DNA多態性分析(RAPD)等技術相結合，對常見腸道致病菌，如志賀菌、沙門菌和致病性大腸桿菌O157：H7等進行檢測與鑒定。結果 uidA引物可特異擴增沙門菌、志賀菌及大腸桿菌，而3種特異性引物則只擴增相應的致病菌;第一次PCR敏感性。退火溫度為55

20、6;C在最后10個周期。用QIA快速純化擴增產物（QIAGEN，克勞利，英國），和DNA濃度測定OD260測定純化擴增溶液。DGGE，用250 ng純化擴增產物。DGGE使用D編碼系統（Bio-Rad實驗室，大力士，CA，USA）。（8%）丙烯酰胺凝膠電泳制備和0.5×三醋酸EDTA（TAE）緩沖液（1×TAE緩沖區由0.04 M Tris堿，0.02 M醋酸鈉，pH值為7.4和10毫米EDTA ）。DGGE凝膠含有2070%尿素和甲酰胺梯度電泳方向為變性劑。100%變性劑為存在40%（v/v）甲酰胺7 M尿素。DGGE進行在一個恒定的35 V電壓在60°C 24

21、小時。一個擴增16S rDNA片段的混合物作為合成標記，包括擴增16SrDNA片段atrocyaneus節桿菌ATCC 13752，從海水樣品中獲得的克隆，與物種相關的balneatrix alpica，農桿菌gelatinovorum，methylomicrobium專輯，馬尾藻海菌，sulfitobacter pontiacus，Erythrobacter sp.和海洋球石藻質體。凝膠用SYBR金核酸凝膠染色（分子探針尤金，或，美國）和使用UV透照儀拍。DGGE帶譜是用圖像分析系統分析（Image Master，Pharmacia公司，烏普薩拉，瑞典），這條帶密度和遷移距離的計算。用eq2

22、計算每DGGE條帶模式之間的相似性。Cs =2j/(a +b) 在這里，J是凝膠車道A和B之間的共同條帶數，A和B是在凝膠車道A和B的總帶數，分別。從DGGE凝膠圖像的觀察，兩條帶只有對C.白蟻喂食人工飼料的苯酚的車道觀察仔細切除用刀片在紫外光照下，然后放在一個100l Tris-EDTA緩沖。DNA在4°C 3 d的培養從凝膠塊中提取出來，然后0.5L的表面上層作為一個引物GC-2進行降溫PCR模板DNA（5- gaagtcatcatgaccgttc tggcacggggggccta-3）（10）和譜。的降落PCR擴增混合條件相同那些用于DNA擴增DGGE如上。由此產生的擴增產物電

23、泳DGGE凝膠再次核實原帶的位置。隨后，利用卡快速純化擴增產物（QIAGEN）。然后他們被克隆到pGEM-T Easy載體系統（Promega公司，麥迪遜，WI美國）。連接產物轉化大腸桿菌DH5感受態細胞-。隨機篩選白色菌落，直接用菌落PCR使用的引物（引物T7載體插入、三陰交）。使用卡準備小量質粒提取試劑盒克隆制備質粒DNA（QIAGEN）。質粒DNA進行測序根據插入方向利用CEQ 2000 XL（貝克曼，富勒頓，CA，USA）。所有的序列進行分析，利用DNAStar Seqman（，麥迪遜，WI，USA）。隨后，該序列進行比較通過執行BLAST生物相似的序列搜索（12，13）。序列數據用C

24、lustal對齊W包（14）。Plate Wash (PW)-PCR-DGGE analysis結果表明，苯酚降解菌在增加C.白蟻喂食使用膜過濾法苯酚的人工飼料腸道數。然而，他們的具體名稱和多樣性不明確。因此，對膜過濾所有的苯酚降解菌生長的一種有效的分析進行。所有的細菌菌落，分別由培養C.腸道微生物對膜形成。白蟻喂木酚人工飼料被表面在無菌蒸餾水放入1.5毫升微管。懸浮液通過離心收集（12000×G，10分鐘）。所有的細菌菌落總DNA，運用快速DNA提取試劑盒，采用PCR-DGGE方法如上分析。Nucleotide sequence accession number部分16S rRNA

25、基因序列已存入 序列的核苷酸序列數據庫下面的登錄號：帶A-1，A-2 ab277362；帶，ab277363；帶A-3，ab277364；B級，ab277365；WF-1，ab277366；WF-2，ab277367；WF-3，ab2773628；PF-1，ab277369；為，ab277370； PF-3，ab277371；結締組織生長因子，ab277372；Pf-5，ab277363；和pf-6，ab277364。RESULTS AND DISCUSSION人工飼料對C.白蟻存活率的影響。表明人工飼料的影響對C.白蟻的存活率。喂養與木粉C.白蟻的存活率，瓊脂糖人工飼料，或餓死，95%，80

26、%或57.3%，20 d后分別，另一方面，生存率C.白蟻喂食人工飼料含50和100 mg/L苯酚分別為38.7%和17.3%，分別。所有的C.白蟻喂人工飼料含150和200 mg/L苯酚內死亡15 D.雖然白蟻觀察吃木粉，瓊脂糖，和人工飼料含50和100 mg/L的苯酚，白蟻不吃含有150和200毫克/ L的酚人工飼料。這意味著只有一個非常小的量的含150和200的人工飼料mg/L的苯酚，苯酚，被帶進他們的腸道。這些結果表明C.白蟻的人工飼料的苯酚列入降低生存率因為苯酚是一種有毒物質，抑制細胞質的功能（15）。在C.白蟻喂酚人工成活率減少飲食是高于C fomosanus聯儲瓊脂糖和C.白蟻被餓

27、死。這一結果表明，在C.白蟻喂食人工飼料的苯酚數量迅速減少的主要原因不是饑餓但苯酚毒性。需要注意的是，有趣的是雖然一些C.白蟻在幾天內死亡，另外的的生存很長一段時間。因此，它的出現 C.白蟻個體的敏感性不同 酚的毒性雖然他們來自相同的父母生活在這同一個殖民地。C.生存水平 白蟻喂人工飼料含酚可能被認為是漸進的步驟，包括階段：（I）對苯酚耐受毒性，（ii）解毒由于苯酚降解苯酚的存在在C.白蟻喂養腸道微生物木材.（iii）在苯酚降解能力由于苯酚降解微生物在C.白蟻喂食人工飼料的苯酚腸道倍增。它是可能的，只有C.白蟻個體有耐酚可以生存的最初。隨后，在他們的腸道微生物繁殖的苯酚降解，延長他們的生存。我

28、們建議C.白蟻生存期可作為鑒別個人窩藏苯酚降解微生物的其他指標。因此，本研究建立的篩選方法是一種有效的新方法，在昆蟲的人工飼料含苯酚微生物在腸道繁殖所需的成功。這些期望的微生物是從生存的昆蟲分離。人工飼料對其體重的影響C.圖2顯示了在C.白蟻的重量變化在飼養試驗。C.白蟻吃木頭的初始平均體重（喂養人工飼料0 d）3.94毫克。20 d后，C.白蟻取食木粉的重量，瓊脂糖和人工飼料含100 mg/L苯酚降低到3.42，2.41和2.22毫克，分別。這些結果表明，C.白蟻生存抑制苯酚，與木粉比較，瓊脂糖苯酚人工飼料降低白蟻的重量.Effects of artificial diets on inte

29、stinal protozoan communityof C. Formosanus在C白蟻吃木頭腸道原蟲總數的變化， 瓊脂糖和人工飼料含100 mg/L苯酚如圖3所示。但在C.白蟻喂食人工飼料的瓊脂糖和苯酚的腸道原蟲的數量迅速減少。所有的pseudotrychonympa Grassi（大型原生動物）和holomastigotoides hartmanni（中原生動物）5 d后，所有的spyrotrychonympha leidyi消失（小原生動物）后10 d喂養這些人工飼料的消失。這些原生動物的消失是在量的降低相一致的白蟻，如圖2所示。據報道，腸道原蟲約占1 / 3的低等白蟻的總重量. 在

30、這項研究中，權重C.白蟻個體飼喂瓊脂糖和苯酚的人工飼料減少到超過1 / 3的權重。因此，除了物理量的影響原生動物，它們消失的原因可能有其他生理 這導致C.白蟻的重量進一步降低的影響人工飼料對腸道總數的影響C.白蟻菌在C白蟻吃木頭的腸道細菌總數的變化粉，瓊脂糖和人工飼料含100 mg/L苯酚如圖4所示。在美聯儲與C.白蟻腸道細菌的數量迅速減少瓊脂糖和苯酚的人工飼料。細菌總數的最初4×107細胞/腸（木料）但少于1 / 10（2.8×106細胞/腸）當他們喂酚人工飼料。M檢測苯酚降解微生物C.腸道微生物的測定采用瓊脂平板OS 500圖5顯示了通過電鍍CFU /腸道腸道微生物數量

31、得出C.白蟻在500瓊脂平板喂養后，木材，瓊脂糖和100 mg/L苯酚人工10天的飲食. C.白蟻吃木頭的CFU /腸數，瓊脂糖和100 mg/L苯酚3.4 104 5.4 10 4×，××105和1.9，分別。隨后，85微生物菌落從C.白蟻喂食100毫克/ L酚人工飼料的腸道微生物隨機挑選和苯酚的降解能力 進行了研究。結果表明，85群落中的83不能降解苯酚。因此，雖然很高從C.白蟻個體的腸道得到CFU / gut的100 mg/L苯酚的人工飼料，最（97.6%）無苯酚降解能力。因此，在500瓊脂平板的不合適苯酚降解微生物的檢測和定量因為nonphenol降解微生

32、物也形成的菌落，在500瓊脂平板。與500瓊脂平板，都可培養微生物耐500 mg/L的苯酚，苯酚和代謝，瓊脂或瓊脂寡糖形成群體。因此，的500瓊脂平板法不能用于分離苯酚降解微生物。檢測和定量的苯酚降解從腸道微生物菌C.當使用膜過濾法與常用的500瓊脂平板法，微生物沒有降解苯酚但消耗其他介質成分如瓊脂，瓊脂寡糖也形成了殖民地。因此，定量檢測苯酚降解菌，膜過濾器只使用苯酚作為碳源的方法。該方法不使用，瓊脂，和microorganismswere收集在濾膜在液體介質通過膜提供。在這種方式中，只有微生物降解和代謝的含酚在液體培養基中生長并形成克隆。圖6顯示了形成在CFU /腸數膜過濾器。C.白蟻腸道微

33、生物美聯儲與木材，瓊脂糖和100 mg/L苯酚人工10天的飲食進行膜過濾和飽和500介質。一些殖民地（200 CFU /腸）從C.白蟻腸道微生物的檢測美聯儲的木材和瓊脂糖人工飼料。在另一方面，在2.8×103 CFU /腸道菌落檢測從C.白蟻腸道微生物喂養用100 mg/L的苯酚的人工飼料。五十殖民地從隨機挑選的殖民地和他們的苯酚降解能力的影響。結果表明，所有的50個殖民地降解苯酚。此外，該薄膜過濾器的方法被用來比較CFU /腸數的微生物從C.白蟻腸道喂養用50 mg/L的苯酚與微生物飼料從C.白蟻喂食100毫克/升苯酚的人工飼料。CFU /腸C.白蟻的數量美聯儲的100mg/L苯酚

34、人工飼料高（2.8×103 CFU /腸），但只有少數的殖民地（5×102CFU /腸）是從腸道微生物檢測C.白蟻喂養的Wi. 這意味著，苯酚降解的密度隨著增加的白蟻腸道微生物在他們的飲食中酚濃度。因此，對于苯酚降解菌的增殖C.白蟻腸道，更應加入苯酚人工飼料但是酚濃度不應很高，明顯減少攝食活動，因此影響生存.Table1 顯示細菌總數和酚降解 微生物檢測用膜濾波法和苯酚降解菌的比例C.白蟻腸道喂養木酚10 D.人工飼料對腸酚降解率微生物C.白蟻個體取食人工飼料的木酚×5 10 61×103，分別。這兩個比率建議苯酚降解菌的數量顯著增加約200倍，與喂養C

35、.白蟻苯酚的人工飼料。這些結果表明，膜過濾法是檢測苯酚降解效果微生物，而苯酚的數量降解微生物在腸道增加C.白蟻喂人工飼料含100毫克/升苯酚。PCR-DGGE analysis采用膜過濾方法，結果表明，培養的數量C中的苯酚降解菌增加腸道白蟻喂食人工飼料的苯酚。然而，許多微生物不能培養的也可以在這樣的白蟻腸道。PCR-DGGE技術，這是一般用于細菌群落分析結構，因此被用來分析所有的細菌的白蟻腸道。此外，腸道微生物C.白蟻喂酚人工飲食與傳統的比較富集培養。Tu7顯示腸道細菌帶模式C.白蟻飼喂三種類型的社區飲食，與腸道微生物食木C.白蟻的富集得到的文化tu8顯示基于差異的聚類分析在細菌的帶紋相似利用

36、索倫森方程的社區。之間的相似性在C.白蟻細菌群落饋木材和人工飼料飼喂苯酚35%，而細菌群落之間的相似性在C.白蟻喂食和喂酚瓊脂糖人工飼料為58%。之間的相似性C.白蟻喂酚人工微生物飲食和那些通過富集培養獲得只有12%。這些結果表明，該結構C.白蟻細菌群落的變化很大對人工飼料的類型。然而，腸C.白蟻喂酚細菌群落人工飼料較為相似，C.白蟻喂人工飼料的瓊脂糖。喂養C.白蟻與飲食導致的消失腸道原蟲和總數的減少細菌（小于1 / 10）后10天。這是眾所周知的，C.白蟻腸道中，有一個嚴格的共生關系許多原生動物和細菌之間的（見參考文獻2和參考文獻）。腸道的重要功能之一原生動物是吞噬（16）。因此，消失在C.

37、白蟻飼喂人工腸道原蟲含苯酚的影響腸道細菌群落的飲食。換句話說，對腸道的消失原生動物是一重要因素，LED增加苯酚降解菌在腸道的數量C.白蟻。此外，這些結果表明，細菌群落從C.白蟻腸道喂養的獲得苯酚的人工飼料，不同于那些通過用500中富集培養。在這項研究中，富集培養進行分批，使用L形的試管（厭氧好氧條件下條件，沒有微生物生長和苯酚消費）。因此，培養條件如苯酚濃度、介質的pH值的變化在培養。另一方面，在C.腸白蟻，養分供給不斷向腸微生物（由C.白蟻取食活動），而微生物代謝產物如有機酸被吸收不斷去除在腸壁或排泄通過排氣。因此，C.白蟻腸道可以比作一個continuousculturecontinuou

38、sculture系統。低增長率（這些微生物不能利用飲食成分）被淘汰，而高增長率的微生物（那些能有效地利用飼料成分）被保留，成為腸道優勢種群。數從腸道細菌群落得到帶C.白蟻喂食人工飼料大苯酚比獲得(tu7). 這結果表明，從微生物的種類C.白蟻腸道喂養人工飼料是苯酚比微生物通過物種更加多樣傳統的富集培養。據報道那是在腸道中的氧濃度梯度白蟻（17）。因此，這種變化在腸道內環境使許多微生物適應各種環境（氧濃度）和C.白蟻腸道中成長。DNA序列的帶A和B，如圖7所示進行了分析。帶A和B得到唯一的樂隊從白蟻腸道微生物喂人工飼料的苯酚。DNA比對序列如圖9所示。Table2表明菌株加入一些細菌的同源性最高

39、在帶A和B，一個DNA序列該序列有98%的同源性，與樂隊假單胞菌（ef107515）。這種細菌應變已被報告為1,2,4-三氯苯的降解。雖然細菌降解芳香族化合物等苯酚和氯苯在腸道中幾乎不存在食木C.白蟻，它們的數量在增加這樣的高濃度待測DNA條帶當C.白蟻喂人工飼料的苯酚。其他的DNA序列中包含有帶A和B高同源性不能培養crostridium和擬桿菌，他們的功能都不知道。苯酚的降解（CO2和H2O是完全降解）發生在有氧條件下，但上述結果表明在腸道也存在嚴格厭氧菌投喂人工飼料微生物酚白蟻。它們的功能是未知的但是他們能降解苯酚。苯酚的降解主要發生在已報道好氧條件下（18），但厭氧降解也報道（19）。

40、這表明，厭氧降解苯酚可能發生在C.白蟻腸道通過嚴格厭氧菌如脆弱類桿菌和梭菌。PWPCR-DGGE analysisTu10顯示數字的DGGE帶檢測在每個車道和DGGE條帶的DNA序列。在每個車道correnumber DGGE條帶數檢測苯酚的降解微生物物種分離C.白蟻腸道喂養人工飼料的苯酚（9 DGGE條帶）大于孤立的物種從木材喂養C.白蟻腸道（常規法）（3 DGGE條帶）DGGE條帶WF-1，WF-2和WF-3檢測殖民地從木喂養C.白蟻腸道微生物具有很高的同源性與甲型副傷寒沙門氏菌50973株（同源性為99%），svub3氏檸檬酸桿菌（97%）和檸檬酸（99%），分別sp.svub3。DGGE條帶為PF-1，PF-3，PF4，Pf-5和pf-6檢測菌落C.白蟻喂食人工飼料的腸道微生物對苯酚具有很高的同源性與落后的假單胞菌目（99%）細菌，假單胞菌（100%），pdl01蒙昧的假單胞菌目菌（