1、生化檢測實驗講義實驗一 糧食、油料檢驗-脂肪酸值測定法一、 實驗目的糧食在儲藏過程中受到溫度、水分和酶的影響，其脂類物質易發生水解和氧化反應。水解造成糧食游離脂肪酸含量增加，對糧食的種用品質和食用品質產生不良影響。糧食游離脂肪酸含量以脂肪酸值表示,即中和100g糧食試樣中的游離脂肪酸值所需氫氧化鉀的毫克數。通過脂肪酸值的測定，可以判斷糧食品質的變化情況，推測儲藏方法是否適當。通過本實驗要求掌握測定脂肪酸值的技術。二、 原理浸出法。脂肪酸能溶于有機溶劑，利用苯來浸出脂肪酸，然后在酒精溶液中用標準KOH溶液中和脂肪酸，根據滴定時所消耗的堿液數量，就可求出脂肪酸值。三、 材料、儀器和試劑1、材料大米

2、2、儀器帶塞錐形瓶，量筒，移液管，微量滴定管，表面皿，天平，振蕩器，漏斗3、試劑（1）、0.01N KOH（或NaOH）乙醇(95%)溶液先配制約0.5N的KOH水溶液，再取20 ml,用95%乙醇稀釋至500mL（2）、苯，95%乙醇（3）、0.04%酚酞乙醇溶液0.2g酚酞溶于500ml 95%乙醇溶液中。四、操作方法1、浸出稱取事先磨細的大米粉20±O.Olg于200ml或250ml錐形瓶中，加入50ml苯，加塞搖動幾秒鐘后，打開塞子放氣，再蓋緊瓶塞置振蕩器振蕩30min(或用手振蕩45min)，取出，將瓶傾斜靜置數分鐘，使濾液澄清。注：粉碎后樣品如在20以上室溫放置，脂肪酸值

3、會很快增加，因此，必須及時進行測定。2、過濾用快速濾紙過濾，棄去最初幾滴濾液后用量筒收集濾液25ml。3、滴定將25ml濾液移入錐形瓶中，再用原量筒取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液加入錐形瓶中，立即用氫氧化鉀乙醇溶液滴定至呈現微紅色半分鐘內不消失為止。記下所耗用氫氧化鉀乙醇溶液毫升數V1。4、空白試驗取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液，用氫氧化鉀乙醇溶液滴定，記下耗用氫氧化鉀乙醇溶液毫升數V2。五、結果計算脂肪酸值以中和100g大米樣品中游離脂肪酸所需氫氧化鉀毫克數表示。脂肪酸值=（V1-V2）×N×56.1×50/25×100/W（1-M）V1：滴定

4、樣品所用的氫氧化鉀乙醇溶液體積，ml，V2：滴定25ml酚酞乙醇溶液所用氫氧化鉀乙醇溶液的體積，ml,50：浸泡樣品用苯的體積，ml，25：用于滴定的濾液體積，ml,N：氫氧化鉀(或氫氧化鈉)乙醇溶液的當量濃度，56.1：氫氧化鉀毫克當量，W：樣品重量，M：樣品水分百分率，%100：換算為100g試樣重量。注:浸出液顏色過深，滴定終點不好觀察時，改用四折濾紙，在濾紙錐頭內放入約0.5g粉末活性碳，慢慢注入浸出液，邊脫色邊過濾。六、思考題1、糧食脂肪酸值測定的意義？實驗二 鄰甲苯胺法測定血糖濃度一、實驗目的1、掌握鄰甲苯胺血糖測定法的基本原理及操作方法。2、了解鄰甲苯胺血糖測定法的臨床意義及應用

5、。二、原理血漿樣品中的葡萄糖在酸性環境中與鄰甲苯胺共熱時，葡萄糖脫水轉化為5-羥甲基-呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺結合為藍綠色的醛亞胺（Schiff鹼）。血清中的蛋白質則溶解在冰醋酸和硼酸中不發生混濁。將標準葡萄糖溶液與樣品按相同方法處理，在680nm波長處比色，即可測得樣品中葡萄糖含量。三、材料、儀器和試劑1、實驗材料：新鮮血漿2、儀器722型分光光度計，水浴鍋，試管3、試劑1、 鄰甲苯胺試劑稱取硫脲2.5g，溶于冰醋酸750ml中。將此溶液轉入1L容量瓶內，加鄰甲苯胺150ml，2.4硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可應用2個月。2、 葡萄糖貯存標準液（100mg/m

6、l）將少量無水葡萄糖置于硫酸干燥器內一夜。精確稱取此葡萄糖1.000g，以飽和苯甲酸溶液溶解并轉移入100ml容量瓶內，再以飽和苯甲酸溶液稀釋至100ml刻度。置冰箱中可長期保存。3、 葡萄糖標準液（1.5mg/ml）在100ml容量瓶內，加入葡萄糖貯存標準液15.0ml，用飽和苯甲酸溶液稀釋至100ml刻度，混和。4、 12mmol/L苯甲酸溶液稱取苯甲酸1.4g，加入蒸餾水900ml,加熱助溶，冷卻后加蒸餾水至1000ml。四、實驗操作1、采得待測血樣（抗凝）后立即離心以分離血漿（3,000轉離心15分鐘）。2、取干燥試管3支，分別標出號碼，按下表添加試劑。鄰甲苯胺法測血糖操作表管別試劑(

7、ml)測定管標準管空白管血清（漿）0.20ml葡萄糖標準液0.20ml蒸餾水0.20ml鄰甲苯胺試劑6.0ml6.0ml6.0ml3、混勻各管內容物置沸水浴中加熱15分鐘后取出用流水冷卻。4、以空白管校正零點，讀取各管680nm處吸光度值。五、結果計算 六、思考題1、如何獲得血漿？血漿的主要成分是什么？血液由細胞部分和非細胞部分組成。細胞部分（占45）有紅細胞、白細胞、血小板；非細胞部分（占55）是血漿，血漿的主要成分是水、蛋白質、糖類、脂類、激素、無機鹽等。離開血管的全血經抗凝處理后，通過離心沉淀，可獲得不含細胞成分的液體，即血漿。2、測定血糖時為什么要在空腹狀態下取血？3、試討論

8、血糖測定的臨床意義及應用？附：注意事項1、本法不需要除去蛋白質，鄰甲苯胺試劑只與糖醛起反應，不與血中其他還原物質起反應。2、顯色反應與水的含量有關，故應使標準管和測定管的含水量一致。3、溫度對顯色反應有明顯影響，煮沸時間和溫度應準確控制。4、顯色后顏色不穩定，室溫每放置1分鐘，顏色降低0.15。5、鄰甲苯胺試劑中冰醋酸濃度很高，使用不當容易損壞比色儀器。6、鄰甲苯胺是致癌劑，測定過程中應小心使用。實驗三 不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶一、目的掌握不連續聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的基本原理和操作方法，同時對同工酶有一個感性的認識。二、原理不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同凝膠孔徑和不

9、同緩沖系統的電泳。系統的不連續性體現在：1、凝膠板的不連續性凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2、緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同樣品緩沖液（pH6.7的Tris-HC1），濃縮膠緩沖液（pH6.7的Tris-HC1），分離膠緩沖液（pH8.9的Tris-HC1）和電極緩沖液（pH8.3的Tris-甘氨酸）3、電位梯度的不連續性在這樣一個不連續的系統里，存在三種物理效應，即電荷效應、分子篩效應和濃縮效應。在這三種效應的共同作用下，待測物質被很好地分離開來。（1）、樣品的濃縮效應濃縮效應：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原

10、來很稀的樣品得到高度濃縮。在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH 6.7，下層分離膠為pH 8.9。HCl是強電解質，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl布滿整個膠板。待分離的蛋白質樣品加在樣品槽中，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，有效泳動率最大的Cl迅速跑到最前邊，成為快離子（前導離子）。在pH6.7條件下，甘氨酸（pI=6.0）很少解離，其有效泳動率很低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個不斷移動的界面。帶負電荷的蛋白質，其有效泳動率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐

11、漸形成一個區帶。由于快離子快速向前移動，在快離子的后邊形成一個離子濃度低的區域即低電導區。因為電位梯度V、電流強度I和電導率S之間有如下關系：V=I/S。所以在電流恒定條件下低電導區兩側就產生了較高的電位梯度。這種在電泳開始后產生的高電位梯度作用于蛋白質和甘氨酸慢離子加速前進，追趕快離子。當快離子和慢離子的移動速度相等時，則快離子和慢離子之間形成一個穩定而又不斷向陽板移動的界面。也就是說在高電位梯度區和低電位梯度區之間的地方形成一個迅速移動的界面，由于蛋白質樣品的有效遷移率恰好介于快慢離子之間，因此也就聚焦在這個移動的界面附近，被濃縮形成一個狹小的中間層。由于兩層凝膠孔徑不同，蛋白質向下移動到

12、兩層凝膠界面時，阻力突然加大，速度變慢,使得在該界面處的待分離蛋白質區帶變窄，濃度升高。這就是所謂的濃縮效應。在此區帶中，各種蛋白質又按其電荷而分成不同層次，在進入分離膠前被初步分離，形成若干條離得很近但又不同的“起跑線”。當蛋白質和慢離子都進入分離膠后，pH從6.7變為8.9，甘氨酸解離度劇增，有效遷移率迅速加大，使它越過蛋白質并直接在Cl-后移動。不連續的高電位梯度不再存在。于是，此后的電泳過程中，蛋白質分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動，并根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。與連續系統相比，不連續系統的分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。由于電泳基質的四個不連續性，使

13、樣品在電泳開始時，得以濃縮，然后再被分離。（2）、分子篩效應分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同，因此表現出不同的遷移率。（3）、電荷效應每種蛋白質分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術，分離小麥幼苗過氧化物酶同工酶，根據酶的生物化學反應，通過染色方法顯示出酶的不同區帶，以鑒定小麥幼苗過氧化物酶同工酶。三、材料、儀器和試劑1、實驗材料小麥幼苗2、儀器（1）垂直板電泳槽及附件（玻璃板、硅膠條、梳子、導線等）（2）穩壓穩流直流電泳儀（3）高速離心機（10,000r/min）（4）量筒：500mL×1，10mL×

14、1，5mL×1（5）燒杯：250mL×4（6）微量注射器（50L）（7）其他：玻棒、大培養皿等3、試劑序號試 劑 名 稱配 制 方 法11.5瓊脂1.5g瓊脂，100mL pH8.9分離膠緩沖液浸泡，用前加熱溶化。2分離膠緩沖液，pH8.9(pH8.9 Tris-HCl緩沖液)取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用無離子水溶解后定容至100 mL。3濃縮膠緩沖液，pH6.7(pH6.7 Tris-HCl緩沖液)取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用無離子水溶解后定容至100 mL。4分離膠丙膠貯液(Acr-Bis貯液)Acr 28

15、.0g，Bis 0.735g，用無離子水溶解后定容至100 mL，過濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4保存。5濃縮膠丙膠貯液(Acr-Bis貯液)Acr 10g，Bis 2.5g，用無離子水溶解后定容至100 mL，過濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4保存。610過硫酸銨溶液（Ap）10g過硫酸銨溶于100 mL無離子水中(當天配制)。7四甲基乙二胺（TEMED）原液。8核黃素溶液核黃素4.0mg，無離子水溶解后定容至100mL。9電極緩沖液，pH8.3(pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液)Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于無離子水后定容至1 000 mL，用時稀釋10倍。1040蔗糖溶液

16、蔗糖40 g，溶于100 mL無離子水中。11pH4.7乙酸緩沖液乙酸鈉70.52 g，溶于500 mL蒸餾水中再加36 mL冰乙酸，蒸餾水定容至1 000 mL。127乙酸溶液19.4 mL 36乙酸稀釋至100 mL。13樣品提取液，pH8.0(pH8.0 Tris-HCl緩沖液)Tris 12.1 g，加無離子水1 000 mL，以HCl調節pH至8.0140.5溴酚藍溶液0.5 g溴酚藍溶于100 mL無離子水中。15聯大茴香胺染色液聯大茴香胺250 mg溶于140 mL 95乙醇中，加20 mL蒸餾水，使用前加3H2O2 5 mL（當天配制）四、實驗步驟1、夾心式垂直電泳槽的安裝（1

17、）將電泳用的玻板，洗凈烘干備用。（2）將長短玻璃板分別插在凹形橡膠框中，安裝成凝膠模具。切勿用手接觸兩玻璃板相對的內面。（3）將安裝好的凝膠模具安放在儲液槽之間，注意短玻璃板面對負極，插上固定螺絲將儲液槽和凝膠模具固定好，固定螺絲在擰緊時應雙手以對角線的方式旋緊螺絲。（4）待電泳槽安裝好后，用膠頭滴管沿長玻璃板外側面將瓊脂灌入，將長玻璃板下部與膠框的縫隙密封，注意不要產生氣泡。一旦用瓊脂封板后，模具不應再挪動，以防產生裂縫在灌膠時發生泄漏。2、凝膠的制備將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。按下表比例配制分離膠分離膠取樣表名稱分離膠緩沖液分離膠丙膠貯液10%APTEMED無離子水用量m

18、L360.030.0615加過硫酸銨前，溶液應抽氣。將分離膠沿長玻璃板加入膠室內，小心不要產生氣泡，加至距短玻璃板頂端3cm處，立即覆蓋23mm的水層，靜置待聚合（約40min），當膠與水層的界面重新出現時表明膠已聚合。按下表比例配制濃縮膠濃縮膠取樣表名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠丙膠貯液TEMED核黃素溶液蔗糖用量mL120.0314用濾紙小心吸去表面的水層，切勿破壞膠面的完整性。立即加入濃縮膠，插入梳子（即樣品槽模板），待膠凝后，小心取出梳子。將稀釋10倍的電極緩沖液倒入兩槽中，前槽（短板側）緩沖液要求沒過樣品槽，后槽（長板側）緩沖液要求沒過電極。3、樣品的制備稱取小麥幼苗莖部0.5 g，放入研缽

19、內，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成勻漿，然后以2 mL提取液分幾次洗入離心管，在高速離心機上以8 000r/min離心10min，倒出上清液，以等量40蔗糖及1/5體積溴酚藍指示劑混和，留作點樣用。4、點樣用微量注射器吸取少量樣液，在濃縮膠上層點樣，每個點樣槽15-50L。點樣時須小心，防止樣品液的擴散。5、電泳接好電源線，打開電源開關，調節電流到20mA左右，樣品進入到分離膠后加大到30mA，維持恒流。待指示染料下行到距膠板末端1cm處，即可停止電泳。把調節旋扭調至零，關閉電源，電泳約3h。6、剝膠電泳結束后，取出電泳膠板，去掉膠套，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切

20、下一角作為加樣標記，在兩側溴酚藍染料區帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。去掉濃縮膠，用玻棒協助將分離膠放到盛有pH4.7的乙酸緩沖液的大培養皿中浸泡10min。7、染色倒去乙酸緩沖液，加聯大茴香胺染色液，使淹沒整個膠板，于室溫下顯色20min，即得到過氧化物酶同工酶的紅褐色酶譜。該酶活性染色過程如下：過氧化物酶分解H2O2產生氧基，后者使聯大茴香胺發生反應生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝膠時，有過氧化物酶同工酶蛋白質條帶的部位便出現褐色的譜帶。倒掉染色液，重新加入7的乙酸溶液，于日光燈下觀察記錄酶譜，繪圖或照相。五、結果記錄繪制示意圖，將樣品的各個酶帶如實地描繪下來，并計算各酶帶的相對遷移率(

21、Rf)Rf酶帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離測量遷移率時，應以酶帶的中部位置為準六、思考題1、濃縮膠中加入蔗糖的目的是什么？2、分離膠分別在pH4.7的乙酸緩沖液和7乙酸溶液中浸泡的目的是什么？3、過氧化物同工酶染色的原理？4、樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的蔗糖溶液的作用分別是什么？實驗四 谷丙轉氨酶活力測定一、目的1、了解血清谷丙轉氨酶（ALT）活性測定的臨床意義2、掌握谷丙轉氨酶活力的測定方法二、原理在氨基酸的分解代謝過程中，聯合脫氨基是大多數氨基酸的主要代謝方式，通過轉氨基作用與氧化脫氨基作用偶聯完成。本實驗以丙氨酸和a-酮戊二酸作為谷丙轉氨酶作用的底物，利用內源性磷酸吡哆醛作為輔酶，在一定條件及時間作用后來測定所生成的丙酮酸的含量來確定其酶的活力。丙酮酸能與2，4二硝基苯肼結合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在堿性條件溶液中呈棕色，其最大吸收波長為505nm，可用于測定丙酮酸的含量。a-酮戊二酸也能與2，4M硝基苯肼結合生成相應的苯腙而干擾比色