1、色層分離技術色層分離：是一組相關技術的總稱，也稱為色譜 分離或層析分離。慣用法 按固定相的基質（載體）類型分類：層析：載體一般為軟基質的凝膠，常用的有纖維 素、瓊脂糖、交聯葡聚糖、交聯瓊脂糖、 聚丙烯酰胺凝膠等，只適合在低壓下操 作。色譜：載體一般為高強度的經過表面該性的硅膠、 聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，適合在高 壓下使用。 也有人將層析稱為色譜。用途：用在產品的精制階段，目標是獲得合乎使 用要求的產品。色層分離原理l當兩相作相對移動時，利用溶質在互不相溶的兩相中吸附或分配的差異，引起移動速度的不同而進行分離的方法。分 類l流動相與固定相： 流動相：可為氣相、液相、超臨界流體等 固定相：固體

2、、液體和以固體為載體的液體薄層l固定相的形狀： 紙層析 薄層層析 柱層析l操作壓力 低壓：0.5 mpa 中壓：0.5-4.0 mpa 高壓：4.0-40 mpa，用于分析目的l分離操作模式 洗脫展開：最常用 前沿（迎頭）分析 頂替展開用于大量制備l分配機理 根據溶質和固定相間的作用機理 凝膠過濾 離子交換 反相色譜 疏水層析 親和色譜常規的色層分離色層分離過程包含兩部分：l固定相：載體或載體+功能基團l流動相（洗脫液）：緩沖液或有機溶劑 對于高壓液相色譜和低壓層析，操作模式有很大區別。上樣洗脫上樣沖洗洗脫高壓液相色譜分離操作過程層析分離操作過程液相色譜的基本原理和參數l保留時間(tr)和保留

3、體積(vr) 從進樣開始到后來出現樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間，用tr表示。在這段時間內沖洗劑（流動相）流過的體積為保留體積，用vr 表示。ftvrr 色譜流出曲線及參數 容量因子k 和平衡常數k 某物質的k定義為在分配平衡時該物質在兩相中絕對量之比。而平衡常數k為平衡時，物質在兩相的濃度比： )()(msqqk物質在流動相的量物質在固定相的量)/)/(mmssvqvqk物質在流動相的濃度（物質在固定相的濃度msmsvvkqqk vs和vm分別為柱內固定相和流動相所占的體積。于是有 溶質在固定相停留的時間分數= 1kkqqqmss溶質在流動相停留的時間分數 11kqqqmsm 在柱內溶

4、質只有轉移到流動相時才能沿柱的方向向前移動，所以對于一個在柱內有保留的溶質，其譜帶移動速度( )總是小于流動相的移動速度( )，而等于流動相的移動速度與該譜帶對應的溶質在流動相停留的時間分數之積： 而當柱長一定時，溶質譜帶的移動速度和流動相的移動速度與它們通過柱子所花費的時間成反比： bumu)11(kuumbrormbttuu) 1 (0kttrr當柱外死體積可忽略不計時， mrvv0smmmrkvvkvvv00001rrrrrrrtttttttk 選擇性( )和相對保留值( ) = =柱效率： 塔板高度（h）和塔板數（n）是衡量色譜柱 效率的兩個重要指標。 塔板高度（h）：在某一段柱長范圍

5、內溶質在固定相和流 動相之間達到分配平衡，這段柱長就相 當于一個理論塔板的高度(hetp或h)。 12rrtt)1()2(1211kkttrr 理論塔板數的計算公式為： 2)(rtn 式中 為標準偏差。理論塔板高度 為：式中， 柱長。塔板高度小，塔板數高，色譜分離效率高。l影響柱效的因素1）理論塔板高度（ ）隨填料粒度減少而減少；2）在一定范圍內流速減小有利于提高柱效；3）減少沖洗劑粘度或提高柱溫有利于 減小；4）分子量較小的樣品分子 較小。 hnlh lhhh凝膠過濾層析（體積排阻色譜）gel filtration chromatography,gfcsize exclusion chrom

6、atograpy，sec 是一種純粹按照溶質分子在溶液中的體積大小進行分離的層析技術。應用：主要用于蛋白質等生物大分子的分級分離 和除鹽。一般用作原料液的初分離，獲取 幾個不同分子量物質分級，供進一步分離 純化使用。l分離原理： 含有不同分子大小的樣品進入色譜柱（層析柱）后，較大的分子不能通過孔道擴散進入填料顆粒（凝膠珠體）內部，而與流動相一起先流出色譜柱（層析柱）。較小的分子可通過部分孔道、更小的分子可通過任意孔道擴散進入顆粒（珠體）內部。這種顆粒內部擴散的結果，使小分子沿柱流動的速度減慢，使混合樣品中不同的分子按分子大小的順序流出色譜柱（層析柱）從而達到分離的目的。l凝膠過濾介質：良好的凝

7、膠過濾介質應滿足如 下要求：（1）親水性高，表面惰性，即介質與溶質之間不發生任 何化學或物理相互作用； 蛋白質的分級和除鹽效果只與溶質的相對分子量、分子形狀和凝膠結構（孔徑分布）有關，與所用洗脫液的ph值和離子強度等物性無關。（2）穩定性強，在較寬的ph和離子強度范圍以及化學試 劑中保持穩定，使用壽命長；（3）具有一定的孔徑分布范圍；（4）機械強度高，允許較高的操作壓力。常用的分離介質l天然及高分子介質 經常使用的是葡聚糖凝膠（sephadex）、瓊脂糖（sepharose）、瓊脂糖與葡聚糖接枝而成的復合凝膠（superdex）以及聚丙烯酰胺類和聚乙烯醇類合成凝膠（tskgel）。（一）交聯葡

8、聚糖凝膠（sephadex）sephadex g交聯葡聚糖的商品名為sephndex，不同規格型號的葡聚糖用英文字母g表示，g后面的阿拉伯數為凝膠得水值的10倍。例如，g-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣g-200每克干膠吸水20克。交聯葡聚糖凝膠的種類有g-10，g-15，g-25，g-50，g-75，g-100，g-150，和g-200。因此，“g”反映凝膠的交聯程度，膨脹程度及分部范圍。sephadex lh-20，是sephadex g-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質。（二）瓊脂糖凝膠：商品名很多，常見的有，sepharose（瑞典，pharma

9、cia ），bio-gel-a（美國bio-rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網狀結構，網狀結構的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結構是穩定的，可以在許多條件下使用（如水，ph4-9范圍內的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。 （三）聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯成的，經干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠p （bio-gel p），由美國bio-rod廠生產，型號很多，從p-2至p-300共10種，

10、p 后面的數字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝膠 商品為styrogel，具有大網孔結構，可用于分離分子量1600到40,000,000的生物大分子，適用于有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用甲基亞砜。凝膠過濾的特點是凝膠過濾的特點是： 填料多為帶有羥基、但不帶電荷的惰性材料，親水性能好，又不與待分離物質發生作用，因此分離條件溫和，蛋白質回收率高，重現性好；工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離幾百到數百萬分子量；設備簡單、易于操作，周期短。填料再生性好，可連續使用數百次到上千次。功能功能脫鹽：分離大小兩類不同的分子即無機鹽與生物大分子

11、；分級：將分子大小相近的物質分開，通常為大分子間的 分離。缺點缺點： 凝膠強度低，可耐受的壓力通常低于0.2個大氣壓，故流速低，通常的線速度小于20cm/h。因此，處理速度較慢。但superdex的最大耐受壓力可達15個大氣壓，流速也提高近10倍。無機填料： 表面改性后的硅膠，主要是用有機物或聚合物對硅膠顆粒進行處理，增加其親水性并消除或抑制體積排阻以外的其他效應。優點優點： 可耐受較高的壓力，最高壓力可達上百個大氣壓。具有較高的柱效率和分離度。缺點缺點： ph的適用范圍窄。以硅膠為基質的填料，ph范圍在2.0-7.0，如果超過了這個范圍，將會使有機層的溶解速率加快，減少柱子壽命。凝膠特性參數

12、（1）排阻極限（exclusion limit): 凝膠過濾介質的排阻極限是指不能擴散到凝膠網絡內部的最小分子的相對分子質量。不同的凝膠過濾介質品牌具有不同的排阻極限。sephadex g50的排阻極限是30kd。（2）分級范圍（fractionation range): 即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質的相對分子質量范圍。sephadex g-50的分級范圍為1.5 30kd.（3）溶脹率： 某些市售的干燥凝膠顆粒（如sephadex g系列），使用前要用水溶液進行溶脹處理，溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分率稱為溶脹率，即 sephadex g50 的溶脹率為500%30%。（

13、4）凝膠粒徑： 一般為球形，其粒徑大小對分離度有重要影響。粒徑越小，分離效率越高。%100干燥重量干燥重量）（溶脹處理平衡后重量溶脹率 軟凝膠粒徑較大，一般為50 150m，硬凝膠粒徑較小，一般為5 50 m。sepharose 和sephadex凝膠粒徑分布為45 165 m，而superose 和tsk toyopearl hw系列可小到20 40 m，甚至6 10 m。（5）床體積（bed volume） 即1g干燥凝膠溶脹后所占的體積。sephadex g50的床體積為9 11cm3/g干膠。（6）空隙體積（void volume) 指層析柱中凝膠之間空隙的體積，即v0值。空隙體積可用

14、相對分子質量大于排阻極限的溶質測定。一般使用相對分子質量為2000kd的水溶性蘭色葡聚糖。影響分離特性的因素1、填料 分離度和蛋白質的分離范圍以及最小分子量之比是選擇填料要考慮的首要問題。 目前tsk系列凝膠柱被認為是最好的蛋白質分離柱，其特點是分離度高和吸附性小。2、柱長 體積排阻色譜的分離度與柱長的平方根成正比，因此應根據分離的要求確定柱長，一般柱長60-120厘米對于蛋白質的分離比較理想，而長30厘米的柱子多用于快速分離。3、洗脫液 洗脫液的ph值和離子強度都將影響到分離效果。以硅膠為基質的填料，ph范圍在2.0-7.5,如果超出這個范圍，將會使鍵合相的有機層溶解。當離子強度很低時，ts

15、k系列凝膠柱上的硅醇基會與待分離的蛋白發生離子反應，一般通過加入0.3-0.5mol/l的nacl來抑制。蛋白質和柱填料的疏水作用一般通過加入5-10%的乙醇或異丙醇來控制。 3、流速 是影響蛋白質分離的重要因素。一般流速低分離效果好。如流速在小于0.1ml/min時，蛋白質的分離度好；在 0.5-1.0ml/min時，對于7.5mm直徑的柱子，分離效率較高。4、樣品容量 進樣體積和樣品濃度將明顯影響到蛋白質的分離度，高濃度、小體積對分離有利。合適的蛋白質樣品濃度范圍一般在0.01-0.5%，樣品體積是柱體積的1-3%。凝膠篩分的應用1、分離純化 gfc可用于相對分子量從幾百到百萬的物質的分離

16、純化，是蛋白質、肽、脂質、抗生素、糖類、核酸以及病毒（50-400nm）的分離與分析中頻繁使用的液相層析法。2、脫鹽 鹽析沉淀中得到的高鹽濃度的蛋白質溶液用凝膠法脫鹽后，可用于其它層析過程。 也可用于緩沖液的置換。3、相對分子量的測定 通過分子量與分配系數的線性關系進行測量，對球形分子較準確。 分配系數與相對分子量間的關系： m=a - blgmr4、用于包含體的復性實驗技術（一）層析柱 層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外， 直徑加大，

17、洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1 10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1100:1，層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。 （二）凝膠的選擇 根據所需凝膠體積，估計所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠

18、吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如sephadex g-20的吸水量為20，1 克sephadex g200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質采用100-200號篩目的的sephadex g-200效果好， 脫鹽用sephadex g-25、g-50，用粗粒，短柱，流速快。 （三）凝膠的制備 商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大加速膨脹，通常在1-2小時內即可完成。特別是在使用軟膠時， 自然膨脹需24小時至數天

19、，而用加熱法在幾小時內就可完成。這種方法不但節約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內的空氣。 （四）樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過sephadex g-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質樣品的體積為凝膠床的1-4（一般約0.5-2ml），進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10，在蛋白質溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30。 分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。 （五）防止微生物的污染 交聯葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:疊氨鈉（疊氨鈉（nanna