1、我們畢業啦其實是答辯的標題地方肝素鈉的提取及其乳膏制備組員指導老師研究背景肝素鈉的提取分析總結CONTANTS肝素鈉效價的測定肝素鈉乳膏的制備研究背景It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 肝素鈉肝素鈉 (Heparin Sodium ) ：l從動物結締組織的肥大細胞提取的鈉鹽從動物結締組織的肥大細胞提取的鈉鹽,，屬粘多糖類物質。，屬粘多糖類物質。l天然抗凝血物質天然抗凝血物質, 被廣泛用于治療血栓塞、暴發性流腦、敗

2、血癥等被廣泛用于治療血栓塞、暴發性流腦、敗血癥等疾病。疾病。l從生物學角度來講從生物學角度來講, 肝素鈉是一種含硫酸脂的氨基葡萄糖、艾杜糖肝素鈉是一種含硫酸脂的氨基葡萄糖、艾杜糖醛酸和葡萄糖酸的生物活性物質。在機體內它與蛋白質結合成復合醛酸和葡萄糖酸的生物活性物質。在機體內它與蛋白質結合成復合物存在于肥大細胞中物存在于肥大細胞中, 可被蛋白酶解離出來可被蛋白酶解離出來, 它在溶液中呈強電荷的它在溶液中呈強電荷的聚陰離子狀態聚陰離子狀態, 與強堿性與強堿性D208陰離子樹脂有較強的親和力陰離子樹脂有較強的親和力, 易被吸附易被吸附而分離。而分離。研究背景肝素鈉結構式肝素鈉結構式 臨床上肝素鈉的常

3、見劑型包括注射劑和乳膏劑。臨床上肝素鈉的常見劑型包括注射劑和乳膏劑。 乳膏劑是外用法給藥的劑型之一，通過皮膚、孔竅、經絡及病乳膏劑是外用法給藥的劑型之一，通過皮膚、孔竅、經絡及病變局部等部位治療疾病，避免了胃腸道的破壞與肝首過效應，減少變局部等部位治療疾病，避免了胃腸道的破壞與肝首過效應，減少血藥濃度峰谷變化，已成為克服藥物副作用的有效用藥途徑之一。血藥濃度峰谷變化，已成為克服藥物副作用的有效用藥途徑之一。 肝素鈉乳膏劑（肝素鈉乳膏劑（Heparin sodium Cream）常用于早期凍瘡、皸）常用于早期凍瘡、皸裂、潰瘍、濕疹及淺表性靜脈炎和軟組織損傷。裂、潰瘍、濕疹及淺表性靜脈炎和軟組織損

4、傷。 工藝現狀：工藝現狀： 以豬小腸粘膜提取肝素鈉為主；以豬小腸粘膜提取肝素鈉為主； 生產得率較低生產得率較低, 且混有大量有害物質且混有大量有害物質, 不利于臨床應用；不利于臨床應用； 需大量進口需大量進口, 價格昂貴。價格昂貴。研究背景肝素鈉的提取It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 實驗方法：實驗方法：1.原料采集及酶解吸附原料采集及酶解吸附2.離子交換吸附離子交換吸附2.1 D208樹脂預處理樹脂預處理2.

5、2 吸附與洗脫吸附與洗脫 靜態吸附：將上述樹脂加入到已處理好的酶解液中，混勻，調節靜態吸附：將上述樹脂加入到已處理好的酶解液中，混勻，調節pH至至8.5，置于混合器上攪拌過夜吸附。置于混合器上攪拌過夜吸附。 線性洗脫：裝填靜態吸附后的樹脂，按下表配置洗脫液。線性洗脫：裝填靜態吸附后的樹脂，按下表配置洗脫液。 靜態洗脫：取動態洗脫的樹脂于燒杯，加入靜態洗脫：取動態洗脫的樹脂于燒杯，加入4mol/LNacl溶液，攪拌吸附溶液，攪拌吸附30min，取上清液，留樣。，取上清液，留樣。3.肝素鈉的精制肝素鈉的精制試劑試劑體積（體積（ml） 重量（重量（g）3%Nacl1002.93mol/LNacl10

6、017.50.5 mol/L Nacl250.74 mol/L Nacl20046.8肝素鈉的提取實驗結果：實驗結果：1 1. .離子交換吸附離子交換吸附 肝素鈉洗脫曲線圖肝素鈉洗脫曲線圖 在肝素鈉動態洗脫曲線圖中在肝素鈉動態洗脫曲線圖中有一峰谷，代表洗脫出來的是雜有一峰谷，代表洗脫出來的是雜質峰，在此之前和之后分別有一質峰，在此之前和之后分別有一個持續平衡的吸光度范圍，其吸個持續平衡的吸光度范圍，其吸光值為光值為0.509-0.513，由此可判斷，由此可判斷A=0.513為儀器在為儀器在220nm處可顯處可顯示的最大吸光度。第二個下降區示的最大吸光度。第二個下降區吸光度由吸光度由0.513下

7、降至下降至0.086，表，表示樹脂上的物質逐漸洗脫完全。示樹脂上的物質逐漸洗脫完全。肝素鈉的提取 在第二個穩定吸光度區（在第二個穩定吸光度區（A=0.513-0.509）收集洗脫液與加入乙醇后對比，呈）收集洗脫液與加入乙醇后對比，呈現明顯的渾濁，見圖現明顯的渾濁，見圖3。其原因可能是由。其原因可能是由于肝素鈉是一種多糖，加入乙醇后通過降于肝素鈉是一種多糖，加入乙醇后通過降低水溶液的介電常數脫水，從而產生沉淀低水溶液的介電常數脫水，從而產生沉淀分離。在反應過程中發現：加熱會使渾濁分離。在反應過程中發現：加熱會使渾濁溶液澄清，而冷凍會增加沉淀析出量，所溶液澄清，而冷凍會增加沉淀析出量，所以反應受到

8、溫度的影響；當然反應過程中以反應受到溫度的影響；當然反應過程中乙醇濃度增大時，沉淀析出量也會增加。乙醇濃度增大時，沉淀析出量也會增加。A=0.509-0.513處洗脫液加入乙醇處洗脫液加入乙醇前（左）和加入乙醇后（右）對比前（左）和加入乙醇后（右）對比圖圖2.肝素鈉的精制肝素鈉的精制白色略黃肝素鈉粉末，共白色略黃肝素鈉粉末，共0.0131g 肝素鈉成品肝素鈉成品肝素鈉的提取肝素鈉的效價測定It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolish

9、ness. 實驗方法：實驗方法：1.效價測定效價測定 按下表處理標準品、樣品及成品：按下表處理標準品、樣品及成品：肝素鈉溶液肝素鈉溶液濃度（濃度（u/mL）血漿（血漿（mL）肝素稀釋液（肝素稀釋液（mL）1% Cacl2溶液（溶液（mL）空白空白-0.25-0.05標準品標準品0.9690.250.20.051.140.250.20.051.3410.250.20.05樣品樣品1號號稀釋稀釋10倍倍0.250.20.05樣品樣品2號號稀釋稀釋10倍倍0.250.20.05成品成品0.000026g/mL0.1250.10.025先加入血漿，置先加入血漿，置370.5恒溫水浴保溫恒溫水浴保溫5m

10、in；取出后加入肝；取出后加入肝素鈉溶液，然后迅速加入素鈉溶液，然后迅速加入1% Cacl2溶液，溶液，370.5恒溫水浴恒溫水浴保溫保溫3min。肝素鈉的效價測定2.2.紫外吸收測定紫外吸收測定 用純水將紫外檢測儀校零（用純水將紫外檢測儀校零（220nm、280nm）,按下表配置溶液按下表配置溶液測定測定 。肝素鈉溶液肝素鈉溶液稀釋倍數稀釋倍數吸光倍數吸光倍數220nm樣品樣品1號號1000.05A樣品樣品2號號1000.05A成品成品51A280nm樣品樣品1號號500.05A樣品樣品2號號500.05A成品成品500.05A肝素鈉的效價測定實驗結果：實驗結果：1.1.肝素鈉的效價測定肝素

11、鈉的效價測定 標準品效價測定中，標準品效價測定中，0.969U/mL標準品管血清出現半凝固標準品管血清出現半凝固狀態，以此管為參照。樣品狀態，以此管為參照。樣品1號、號、2號管血漿均出現半凝固狀態。號管血漿均出現半凝固狀態。樣品效價：樣品效價：0.969U/mL10=9.69 U/mL。成品效價：成品效價： 0.969U/mL0.000026g/mL=37.27U/mg。效價測定半凝固點圖效價測定半凝固點圖（從右至左依次為標準品（從右至左依次為標準品0.969U/mL、樣品樣品1號、樣品號、樣品2號、成品）號、成品）肝素鈉的效價測定實驗結果：實驗結果：2.肝素鈉紫外吸收測定肝素鈉紫外吸收測定

12、于于220nm處測定肝素鈉吸光度，處測定肝素鈉吸光度，280nm處測定殘留蛋白吸處測定殘留蛋白吸光度，結果見下表。蛋白質由于含有色氨酸殘基和酪氨酸殘基，光度，結果見下表。蛋白質由于含有色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其分子內部存在共軛雙鍵，在其分子內部存在共軛雙鍵，在280nm處有一特征吸收峰，但因處有一特征吸收峰，但因肽鍵的存在，在肽鍵的存在，在220nm處也有一吸收峰，故對肝素鈉的紫外測處也有一吸收峰，故對肝素鈉的紫外測定存在干擾。定存在干擾。肝素鈉溶液肝素鈉溶液吸光度吸光度220nm樣品樣品1號號0.1410.705樣品樣品2號號0.1190.595成品成品0.2561.28280nm樣品樣品1

13、號號0.1810.4525樣品樣品2號號0.1530.3575成品成品0.4851.2125肝素鈉的效價測定肝素鈉乳膏的制備It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 實驗方法實驗方法1.乳膏的制備乳膏的制備 處方：處方： 肝素鈉肝素鈉 7.9mg 液體石蠟液體石蠟 11mL 硬脂酸硬脂酸 1.5g 蜂蠟蜂蠟 2.4g 石蠟石蠟 2.6g 硼砂硼砂 0.1g 純水純水 3.3mL 按處方精密稱取液體石蠟、石蠟、硬脂酸、蜂

14、蠟在水浴上加按處方精密稱取液體石蠟、石蠟、硬脂酸、蜂蠟在水浴上加熱融化，并保持溫度熱融化，并保持溫度90，得油相備用。按處方量稱取肝素鈉、，得油相備用。按處方量稱取肝素鈉、硼砂溶解于純水中，并保持溫度硼砂溶解于純水中，并保持溫度90，得水相備用。先將油相，得水相備用。先將油相2/5緩慢加入水相中，邊加邊攪拌至初乳形成。將初乳緩慢滴加至油緩慢加入水相中，邊加邊攪拌至初乳形成。將初乳緩慢滴加至油相中，室溫下迅速攪拌，至溫度下降至室溫，既得肝素鈉油包水相中，室溫下迅速攪拌，至溫度下降至室溫，既得肝素鈉油包水型乳劑。型乳劑。肝素鈉乳膏的制備實驗方法實驗方法2.乳膏的顯微觀察乳膏的顯微觀察取取30%甘油

15、一滴于載玻片上，用玻璃棒蘸取實驗樣品少量，取少甘油一滴于載玻片上，用玻璃棒蘸取實驗樣品少量，取少量蘇丹紅顆粒染色，涂勻，量蘇丹紅顆粒染色，涂勻，40/0.65倍鏡下觀察。倍鏡下觀察。3.質量評價質量評價外觀、感受、酸堿度、焰色反應、效價測定外觀、感受、酸堿度、焰色反應、效價測定穩定性試驗：將乳膏分裝于穩定性試驗：將乳膏分裝于3個塑料燒杯中。個塑料燒杯中。1號杯置于室溫，號杯置于室溫，2號杯置于號杯置于55培養箱中，培養箱中，3號杯置于號杯置于-15冰箱中。冰箱中。24小時后觀察。小時后觀察。肝素鈉乳膏的制備實驗結果實驗結果1.肝素鈉乳膏顯微觀察肝素鈉乳膏顯微觀察 肝素鈉乳膏未經染色時呈現晶塊狀

16、，染色后可明顯觀察到小肝素鈉乳膏未經染色時呈現晶塊狀，染色后可明顯觀察到小顆粒狀油球，表明乳膏出現了一定的均勻狀態，其原理是蘇丹紅顆粒狀油球，表明乳膏出現了一定的均勻狀態，其原理是蘇丹紅在脂類物質中的溶解度大于在溶劑中的溶解度，當接觸脂質類在脂類物質中的溶解度大于在溶劑中的溶解度，當接觸脂質類時，進入脂類內部呈色。時，進入脂類內部呈色。 肝素鈉乳膏（未染色）顯微觀察肝素鈉乳膏（未染色）顯微觀察 肝素鈉乳膏（染色）顯微觀察肝素鈉乳膏（染色）顯微觀察 肝素鈉乳膏的制備實驗結果實驗結果2.肝素鈉乳膏質量評價肝素鈉乳膏質量評價性狀：乳白色肝素鈉乳膏，十分粘稠，細膩無顆粒。性狀：乳白色肝素鈉乳膏，十分粘

17、稠，細膩無顆粒。 酸堿度：酸堿度：pH=7.37焰色反應：火焰呈黃色焰色反應：火焰呈黃色肝素鈉乳膏肝素鈉乳膏肝素鈉乳膏焰色反應肝素鈉乳膏焰色反應肝素鈉乳膏的制備實驗結果實驗結果2.肝素鈉乳膏質量評價肝素鈉乳膏質量評價 效價測定：稀釋效價測定：稀釋0,1,10,20倍數后進行效價測定，每管都出現半凝倍數后進行效價測定，每管都出現半凝固狀態，以未稀釋管計算效價：固狀態，以未稀釋管計算效價：4.845U/g17.72595g=85.88U 穩定性實驗：穩定性實驗：24小時后，分別觀察耐熱、常溫、耐寒條件下肝素小時后，分別觀察耐熱、常溫、耐寒條件下肝素鈉乳膏狀態，可明顯觀察到耐熱試驗中肝素鈉乳膏油水分

18、層。鈉乳膏狀態，可明顯觀察到耐熱試驗中肝素鈉乳膏油水分層。 85.85100%29.17%37.27 7.9肝素鈉乳膏效價測定肝素鈉乳膏效價測定 （從左至右依次為稀釋（從左至右依次為稀釋0、1、10、20倍數）倍數）肝素鈉穩定性實驗肝素鈉穩定性實驗肝素鈉乳膏的制備討論與分析It was the best of times, it was the worst of times; it was the age of wisdom, it was the age of foolishness. 1.工藝流程工藝流程腸粘膜必須新鮮腸粘膜必須新鮮, 由于粘膜污染有許多微生物由于粘膜污染有許多微生物, 長

19、時間保存會發酵產長時間保存會發酵產生肝素酶生肝素酶,分解肝素鈉。分解肝素鈉。酶解一方面使肝素釋放，另一方面又要除去大量雜蛋白，以防大分酶解一方面使肝素釋放，另一方面又要除去大量雜蛋白，以防大分子雜質堵塞樹脂孔徑而影響對肝素分子的吸附。子雜質堵塞樹脂孔徑而影響對肝素分子的吸附。pH略大一方面有利于增大肝素離子化程度，以便于最大程度吸附；略大一方面有利于增大肝素離子化程度，以便于最大程度吸附；另一方面不會對官能團離子化產生大的影響，吸附率下降可能與樣另一方面不會對官能團離子化產生大的影響，吸附率下降可能與樣品中雜質離子化增大后競爭吸附有關。品中雜質離子化增大后競爭吸附有關。乙醇沉淀時乙醇沉淀時, 必須在攪拌的