1、生物技術制藥2第四章第四章抗體制藥抗體制藥生物技術制藥2本章主要內容本章主要內容l第一節第一節 概述概述l第二節第二節 單克隆抗體單克隆抗體l第三節第三節 鼠源性單克隆抗體的改造鼠源性單克隆抗體的改造l第四節第四節 基因工程抗體和抗體工程基因工程抗體和抗體工程l第五節第五節 抗體診斷藥物抗體診斷藥物l第六節第六節 抗體治療藥物抗體治療藥物生物技術制藥2第一節第一節 概述概述l抗體是能與相應抗原特異性結合的具有抗體是能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白免疫功能的球蛋白。l它是機體免疫系統受到抗原物質刺激后，它是機體免疫系統受到抗原物質刺激后，B B淋巴細胞被活化、增殖和分化為漿細胞，淋巴

2、細胞被活化、增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。由漿細胞合成和分泌的球蛋白。生物技術制藥2血清蛋白分為白蛋白、甲種血清蛋白分為白蛋白、甲種()球蛋白、乙種球蛋白、乙種()球蛋白和丙種球蛋白和丙種()球蛋白球蛋白抗體活性存在于抗體活性存在于丙種球蛋白丙種球蛋白組分組分.將具有抗體活性及化學結構與抗體相似的球將具有抗體活性及化學結構與抗體相似的球蛋白統稱為免疫球蛋白蛋白統稱為免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)Ig結構結構生物技術制藥2Ig結構結構可變區可變區恒定區恒定區異種抗原性異種抗原性生物技術制藥2l由于病原微生物是具有多種抗原決定由于病原微生物是具有多種抗原決定簇的

3、抗原物質，因此這些抗體制劑也簇的抗原物質，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，稱為是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗多克隆抗體體，即針對多種抗原決定簇的抗體。，即針對多種抗原決定簇的抗體。它們在應用過程中經常會出現非特異它們在應用過程中經常會出現非特異性交叉反應。性交叉反應。生物技術制藥2第二節第二節 單克隆抗體單克隆抗體l單克隆抗體單克隆抗體是將抗體產生細胞與具有是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。這種抗體是針對

4、一個抗原決定簇的抗這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是由單一的體，又是由單一的B B淋巴細胞克隆產生淋巴細胞克隆產生的，的，故稱為單克隆抗體故稱為單克隆抗體。生物技術制藥2單克隆抗體和多克隆抗體單克隆抗體和多克隆抗體生物技術制藥2免疫學知識免疫學知識: :l人體和動物都有免疫系統，包括特異人體和動物都有免疫系統，包括特異性免疫和非特異性免疫。性免疫和非特異性免疫。生物技術制藥2l宿主的屏障宿主的屏障; ;l吞噬細胞吞噬細胞; ;l正常組織和體液中的抗菌物質正常組織和體液中的抗菌物質; ;l炎癥反應炎癥反應. .非特異性免疫非特異性免疫生物技術制藥2l皮膚皮膚; ;l黏膜黏膜; ;l血腦屏障

5、血腦屏障：由介于血循環與腦實質間的軟由介于血循環與腦實質間的軟腦膜、脈絡叢的腦毛細血管壁和包于壁外腦膜、脈絡叢的腦毛細血管壁和包于壁外的膠質膜所組成，能阻擋病原生物和其他的膠質膜所組成，能阻擋病原生物和其他大分子物質由血循環進入腦組織和腦室。大分子物質由血循環進入腦組織和腦室。 ; ;l血胎屏障血胎屏障：由介于胎盤和母體血循環之間由介于胎盤和母體血循環之間的子宮內膜基蛻膜和胎兒的絨毛膜滋養層的子宮內膜基蛻膜和胎兒的絨毛膜滋養層細胞所組成，可阻擋母體內有害物質進入細胞所組成，可阻擋母體內有害物質進入胎兒體內胎兒體內 。生物技術制藥2生物技術制藥2抗原性物質抗原被分解包涵體溶菌酶進入包涵體抗原碎片

6、吞噬作用生物技術制藥2l不直接殺死病原體，但能配合免疫細不直接殺死病原體，但能配合免疫細胞、抗體或其他防御因子使它們發揮胞、抗體或其他防御因子使它們發揮較強的免疫功能，如補體、干擾素。較強的免疫功能，如補體、干擾素。生物技術制藥2l存在于紅細胞、白細胞和血小板等細存在于紅細胞、白細胞和血小板等細胞和組織中的組胺和胞和組織中的組胺和5-5-羥色胺在機體羥色胺在機體感染病原體而引起炎癥反應時，可使感染病原體而引起炎癥反應時，可使炎癥部位的毛細血管迅速擴張，血流炎癥部位的毛細血管迅速擴張，血流量增加，毛細血管通透性增強，大量量增加，毛細血管通透性增強，大量淋巴細胞從毛細血管穿越進入炎癥區。淋巴細胞從

7、毛細血管穿越進入炎癥區。生物技術制藥2l特異性免疫：當機體受到抗原刺激時，特異性免疫：當機體受到抗原刺激時，體內的抗原特異性淋巴細胞識別抗原，體內的抗原特異性淋巴細胞識別抗原，然后被活化，發生一系列的增殖和分然后被活化，發生一系列的增殖和分化等變化，最終表現出一定的細胞免化等變化，最終表現出一定的細胞免疫或體液免疫。疫或體液免疫。l特異性免疫又分為特異性免疫又分為體液免疫和細胞免體液免疫和細胞免疫疫。生物技術制藥2l細胞免疫細胞免疫主要是指機體受到異己物質抗原主要是指機體受到異己物質抗原的刺激后，一類小淋巴細胞的刺激后，一類小淋巴細胞依賴胸腺的依賴胸腺的T T細胞發生增生，分化，直接攻擊靶細胞

8、細胞發生增生，分化，直接攻擊靶細胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機體達或間接地釋放一些淋巴因子從而使機體達到免疫的過程。到免疫的過程。生物技術制藥2l體液免疫體液免疫是當機體受到抗原刺激后，是當機體受到抗原刺激后，來源于骨髓的小淋巴細胞來源于骨髓的小淋巴細胞BB淋巴細胞淋巴細胞進行增生和分化為漿細胞，進而合成進行增生和分化為漿細胞，進而合成各種免疫球蛋白（抗體），然后在體各種免疫球蛋白（抗體），然后在體液中發揮免疫作用的過程。液中發揮免疫作用的過程。生物技術制藥2第三節第三節 鼠源性單克隆抗體的改造鼠源性單克隆抗體的改造l最初制備的單克隆抗體都是鼠源性的，最初制備的單克隆抗體都是鼠源性的，大量

9、應用于人體時可產生人抗鼠抗體，大量應用于人體時可產生人抗鼠抗體，使其作用和效果都受到嚴重影響，甚使其作用和效果都受到嚴重影響，甚至有毒副作用。至有毒副作用。生物技術制藥2Ig結構結構可變區可變區恒定區恒定區異種抗原性異種抗原性生物技術制藥2改造目的改造目的l改造鼠源性單克隆抗體的目的有兩個：改造鼠源性單克隆抗體的目的有兩個：l1 1、一是降低免疫原性；、一是降低免疫原性；l2 2、二是降低相對分子量，增加組織穿、二是降低相對分子量，增加組織穿透能力。透能力。生物技術制藥2一、人一、人- -鼠嵌合抗體鼠嵌合抗體l抗體同抗原結合的功能抗體同抗原結合的功能取決于抗體分取決于抗體分子的子的可變區，同種

10、性免疫原性可變區，同種性免疫原性則決定則決定于抗體分子的于抗體分子的穩定區。穩定區。l人人- -鼠嵌合抗體：鼠源性單克隆抗體的鼠嵌合抗體：鼠源性單克隆抗體的可變區基因和人免疫球蛋白的穩定區可變區基因和人免疫球蛋白的穩定區基因連接起來，再共轉染骨髓瘤細胞，基因連接起來，再共轉染骨髓瘤細胞，就可表達出完整的人就可表達出完整的人- -鼠嵌合抗體。鼠嵌合抗體。生物技術制藥2二、改形抗體二、改形抗體l用鼠源性單克隆抗體的互補決定區序用鼠源性單克隆抗體的互補決定區序列替換人免疫球蛋白分子中的互補決列替換人免疫球蛋白分子中的互補決定區序列，則可使人的免疫球蛋白分定區序列，則可使人的免疫球蛋白分子具有鼠源性單

11、克隆抗體的抗原結合子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結合特異性。由于抗體分子中鼠源部分只特異性。由于抗體分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。占很小比例，可基本消除免疫原性。最大最大問題問題是抗體的親和力下降，甚至是抗體的親和力下降，甚至喪失活性。喪失活性。生物技術制藥2三、小分子抗體三、小分子抗體l基因工程的小分子抗體僅表達鼠源性單基因工程的小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的可變區，其相對分子量僅為克隆抗體的可變區，其相對分子量僅為原抗體的八十分之一到三分之一。原抗體的八十分之一到三分之一。生物技術制藥2正在研制的小分子抗體正在研制的小分子抗體l1 1、FabFab片段抗體，由完整的輕鏈

12、片段抗體，由完整的輕鏈L L和重鏈的和重鏈的可變區加部分恒定區可變區加部分恒定區(V(VH H+C+CH1H1) )；l2 2、FVFV抗體，抗體，V VH H和和V VL L組成；組成；l3 3、單鏈抗體（、單鏈抗體（SCFVSCFV），由），由 V VH H和和V VL L 通過一通過一段連接肽連接而成的重組蛋白；段連接肽連接而成的重組蛋白；l4 4、單域抗體，由重鏈的或輕鏈的單個可變、單域抗體，由重鏈的或輕鏈的單個可變區（區（ V VH H或或V VL L ）組成；）組成；l5 5、最小識別單位，由互補決定區構成。、最小識別單位，由互補決定區構成。生物技術制藥2生物技術制藥2生物技術制藥

13、2單鏈抗體的優點單鏈抗體的優點 l1 1、分子小，容易滲透到組織中（包括分子小，容易滲透到組織中（包括腫瘤），增加有效藥物濃度；腫瘤），增加有效藥物濃度； l2 2、單鏈易于進行分子改造，如與毒素單鏈易于進行分子改造，如與毒素拼接；拼接；l3 3、免疫原性小，體內半衰期、免疫原性小，體內半衰期短。短。 l缺點：穩定性較低；功能單一；親和缺點：穩定性較低；功能單一；親和力低，穩定性差，體內清除過快。力低，穩定性差，體內清除過快。生物技術制藥2四、雙功能抗體四、雙功能抗體l就是雙特異性單鏈抗體：將抗就是雙特異性單鏈抗體：將抗A抗原抗抗原抗體的輕鏈可變區體的輕鏈可變區(VLA)與抗與抗B抗原抗體抗原

14、抗體的輕鏈可變區的輕鏈可變區(VLB) 通過短肽連接構成通過短肽連接構成的雙鏈抗體。的雙鏈抗體。l結合抗原的兩個臂具有不同的特異性。結合抗原的兩個臂具有不同的特異性。生物技術制藥2雙功能抗體的優點雙功能抗體的優點 l一個臂識別腫瘤細胞表面抗原一個臂識別腫瘤細胞表面抗原，包括，包括腫瘤相關抗原、癌基因產物、特殊的腫瘤相關抗原、癌基因產物、特殊的白細胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特白細胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特異性受體等，并有效結合；異性受體等，并有效結合；另一個臂另一個臂可識別免疫效應細胞及分子可識別免疫效應細胞及分子, ,如如CD3CD3(T(T細細胞識別抗原的單位）胞識別抗原的單位）、毒素、藥

15、物等。、毒素、藥物等。 生物技術制藥2五、抗體融合蛋白五、抗體融合蛋白l構建抗體融合蛋白的原則：將第一個蛋構建抗體融合蛋白的原則：將第一個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，即可實現兩密碼子的第二個蛋白基因，即可實現兩個基因的共表達。個基因的共表達。l抗體酶，酶抗體酶，酶- -抗體型融合蛋白，在藥物抗體型融合蛋白，在藥物治療中有廣闊的前景，它可在靶向位置治療中有廣闊的前景，它可在靶向位置上將前體藥物轉化成有效的藥物，從而上將前體藥物轉化成有效的藥物，從而避免了對正常組織的損害。避免了對正常組織的損害。生物技術制藥2第四節第四節 基因工程

16、抗體和抗體工程基因工程抗體和抗體工程l抗體研究的三大階段：多克隆抗體；抗體研究的三大階段：多克隆抗體；單克隆抗體；以基因工程方法制備抗單克隆抗體；以基因工程方法制備抗體。體。l基因工程抗體基因工程抗體：不用人工免疫動物和：不用人工免疫動物和細胞融合技術，完全用基因工程技術細胞融合技術，完全用基因工程技術制備人源性抗體，而且還能利用基因制備人源性抗體，而且還能利用基因轉移和表達技術，通過細菌發酵或轉轉移和表達技術，通過細菌發酵或轉基因動物、植物大規模生產抗體?；騽游?、植物大規模生產抗體。生物技術制藥2l1 1、獲取目的基因：、獲取目的基因：RNARNA反轉錄反轉錄PCRPCR獲取抗獲取抗體某一

17、特定基因區段；體某一特定基因區段；l2 2、載體：噬菌粒；、載體：噬菌粒；l3 3、淘篩：抗原固相化后，對噬菌粒群吸附、淘篩：抗原固相化后，對噬菌粒群吸附、洗滌和洗脫，再感染擴增，如此反復；洗滌和洗脫，再感染擴增，如此反復；l4 4、表達與鑒定：鑒定目的基因，導入感受、表達與鑒定：鑒定目的基因，導入感受態菌株，表達態菌株，表達 原核細胞、真核細胞、轉原核細胞、真核細胞、轉基因植物和基因植物和 動物等表達方式。動物等表達方式。生物技術制藥2基因工程抗體的表達基因工程抗體的表達l原核生物原核生物 融合表達和分泌表達融合表達和分泌表達l真核生物真核生物 都是分泌表達都是分泌表達l轉基因植物轉基因植物

18、 煙草煙草l轉基因動物轉基因動物 單基因水平。單基因水平。生物技術制藥2第五節第五節 抗體診斷藥物抗體診斷藥物l抗原和抗體的特異性結合在體內和體抗原和抗體的特異性結合在體內和體外都可呈現某種反應。外都可呈現某種反應。在體外可發生在體外可發生凝集或沉淀等反應，可用已知抗體來凝集或沉淀等反應，可用已知抗體來鑒定抗原，作病原學的鑒定抗原，作病原學的診斷診斷和血型測和血型測定，稱為血清學鑒定。定，稱為血清學鑒定。l在體內，可表現為溶菌、殺菌、促進在體內，可表現為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故可治療，吞噬或中和毒素等作用，故可治療，即抗體即抗體治療治療藥物。藥物。生物技術制藥2三大類抗體診斷藥

19、物：三大類抗體診斷藥物：l一、血清學鑒定用的抗體試劑一、血清學鑒定用的抗體試劑l二、免疫標記用的抗體試劑二、免疫標記用的抗體試劑l三、體內導向診斷藥物三、體內導向診斷藥物生物技術制藥2一、血清學鑒定用的抗體試劑一、血清學鑒定用的抗體試劑l血清學鑒定是指用已知抗體來鑒定未血清學鑒定是指用已知抗體來鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的診斷和血型鑒定，常用凝集反應。的診斷和血型鑒定，常用凝集反應。生物技術制藥21 1、鑒定病原菌的抗體試劑、鑒定病原菌的抗體試劑l（1 1）常用品種和用途）常用品種和用途：l診斷血清、分群血清、分型血清、因診斷血清、分群血清、分型血清

20、、因子血清等。子血清等。l（2 2）診斷血清的制備）診斷血清的制備：制備細菌抗原，：制備細菌抗原，免疫動物和制備抗體血清。免疫動物和制備抗體血清。l（3 3）診斷方法）診斷方法：直接凝集反應。：直接凝集反應。生物技術制藥22 2、乙型肝炎病毒表面抗原（、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）的反向被動血凝診斷試劑的反向被動血凝診斷試劑l制備方法，紅細胞經甲醛處理后，在制備方法，紅細胞經甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質，當純化的酸性條件下能吸附蛋白質，當純化的抗乙肝病毒血清吸附其上時便具有抗抗乙肝病毒血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中有乙型肝炎病體活性，若待測樣品中有乙型肝炎病

21、毒表面抗原時，則發生特異性結合反毒表面抗原時，則發生特異性結合反應而使血細胞發生凝集。應而使血細胞發生凝集。生物技術制藥23 3、抗抗ABOABO血型系統血清血型系統血清lABOABO血型抗血清的制備：血型抗血清的制備：l人源性人源性ABOABO血型抗血清是采集健康獻血血型抗血清是采集健康獻血人的血液，凝固后，置人的血液，凝固后，置4 4度過夜，使冷度過夜，使冷抗體吸附在血塊上抗體吸附在血塊上, ,分離血清制備抗體。分離血清制備抗體。生物技術制藥2生物技術制藥2二、免疫標記用的抗體試劑二、免疫標記用的抗體試劑l放射性、熒光或酶標記后將抗原和抗放射性、熒光或酶標記后將抗原和抗體反應放大，提高反應

22、的敏感性，可體反應放大，提高反應的敏感性，可對微量抗原物質進行定性或定量檢測。對微量抗原物質進行定性或定量檢測。結合顯微技術，可定位測定。結合顯微技術，可定位測定。生物技術制藥2l1 1、熒光抗體診斷試劑、熒光抗體診斷試劑l用熒光色素標記抗體，當抗原與抗用熒光色素標記抗體，當抗原與抗體反應時可發光。體反應時可發光。生物技術制藥2生物技術制藥2l2 2、免疫酶抗體診斷試劑、免疫酶抗體診斷試劑l用酶標記抗體來檢測抗原，有免疫酶用酶標記抗體來檢測抗原，有免疫酶染法和酶免疫測定。染法和酶免疫測定。生物技術制藥2生物技術制藥2l3 3、放射免疫用抗體診斷試劑、放射免疫用抗體診斷試劑l把放射性核素分析的高度靈敏度與抗把放射性核素分析的高度靈敏度與抗原抗體反應的特異性結合。原抗體反應的特異性結合。生物技術制藥2生物技術制藥2三、體內導向診斷藥物三、體內導向診斷藥物l以抗體為載體的導向診斷藥物的研究比以抗體為載體的導向診斷藥物的研究比導向治療更接近臨床應用階段。導向治療更接近臨床應用階段。l放射性免疫顯像的優點：在體內有確切放射性免疫顯像的優點：在體內有確切定位腫瘤的作用；在體內可檢出定位腫瘤的作用；在體內可檢出0.50.5厘厘米大小的病灶；小分子抗體容易到達腫