1、銅脅迫下麻瘋樹的生理響應研究physiological response of jatropha curcas researched under copper stress摘 要本試驗利用不同濃度的硫酸銅溶液澆施麻瘋樹幼苗，旨在研究銅脅迫對麻瘋樹幼苗的外部形態(tài)和生理代謝的影響。結果表明：銅脅迫對麻瘋樹幼苗的莖圍和株高生長有一定的抑制作用，在脅迫培養(yǎng)幼苗40天到60天過程中，葉片增長緩慢。麻瘋樹幼苗的生理生化指標變化表現(xiàn)為，丙二醛的含量隨著處理濃度的增加而增加；可溶性糖、葉綠素的含量均比對照組明顯低，葉綠素和可溶性糖的合成受到了抑制。春、秋兩季相比較，春季麻瘋樹幼苗的葉綠素、可溶性糖含量相對較高

2、，丙二醛相對較低。處理組的葉綠素含量在春季最低值為對照組含量的69.9%；而秋季只有對照組的40.3%；丙二醛在銅離子濃度150mg/l時，達到最高值，春季丙二醛含量最高值是對照組的1.7倍，秋季最高值是對照組的1.8倍。試驗證明，銅脅迫對麻瘋樹幼苗生長和生理代謝有一定抑制作用。關鍵詞：麻瘋樹；銅脅迫；葉綠素；丙二醛abstractthe experiment researched morphologies of jatropha curcas seedling and the effect of physiological metabolism in varied content of cu

3、(so4)2. the showed the height and stem of jatropha curcas would be inhibited by copper, leaves grew slow during culture.the content of mda would increase with content of copper increase. the concentration of soluble sugar and chlorophyll would greatly reduce, and indicated the synthesis of chlorophy

4、ll and soluble sugar might be inhibited by copper. the content of two kinds things will change with seasons varied, in spring which was higher than that in fall.the experiment groups minimum content of chlorophyll was less than control group.in 150mmol/l cu(so4)2, content of mda was the highest. mda

5、 content in the spring of the highest value is 1.7 times of the control group, that of in autumn is 1.8 times of control. the result showed copper would inhibit the growth of jatropha curcas seedling and physiological metabolism.key words: jatropha curcas;copper stress; chlorophyll; mda目 錄1.前言.12.材料

6、與方法.32.1材料.32.1.1植株種子.32.1.2實驗儀器.32.1.3實驗藥品.32.1.4培養(yǎng)液及培養(yǎng)基質.32.2方法.42.2.1種子的萌發(fā)實驗.42.2.2幼苗前期培養(yǎng).42.2.3銅離子脅迫培養(yǎng).42.2.4指標測定.43.結果與分析. 63.1銅離子對麻瘋樹幼苗外部形態(tài)的影響.63.1.1銅離子對麻瘋樹幼苗莖圍生長的影響.63.1.2銅離子對麻瘋樹幼苗株高生長的影響.63.1.3銅離子對麻瘋樹幼苗葉片生長的影響.63.2銅離子對麻瘋樹幼苗生理生化的影響.73.2.1銅離子對麻瘋樹幼苗丙二醛（mda）的影響.73.2.2銅離子對麻瘋樹幼苗葉綠素a、b、總葉綠素的影響. 73.

7、2.3銅離子對麻瘋樹幼苗可溶性糖的影響.84.討論.95.結論.11參考文獻12致謝141.前言重金屬污染,實際上主要涉及汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷等生物毒性顯著的重金屬,也指具有一定毒性的一般重金屬如鋅、銅、鈷、鎳、錫等。而隨著礦質資源的開發(fā)與利用，大量的重金屬元素被釋放進入環(huán)境，對土壤、水體造成污染。土壤重金屬污染具有隱蔽性、長期性和不可逆性的特點，并通過接觸、食物鏈等途徑直接或間接危害人類健康，輕則發(fā)生怪病（水俁病、骨痛病等），重者就會死亡等。如銅：土壤中的銅通過物理或化學和生物變化，成為不同形態(tài)的銅，影響土壤的正常功能。當人體銅攝入量不足時可引起缺乏病，但攝入過量卻又可能造成中毒，包括

8、急性銅中毒、肝豆狀核變性、兒童肝內膽汁淤積等病癥。明顯降低植物的生物產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量1-3。鑒于重金屬的危害，許多科學家積極研究治理土壤重金屬污染的方法和途徑：(1)改變重金屬在土壤中的存在形態(tài),使其固定，降低其在環(huán)境中的遷移性和生物可利用性，如：石灰，腐殖質，有機質；(2)從土壤中去除重金屬,使其存留濃度接近或達到背景值。圍繞這兩種治理途徑,已提出相應地物理、化學和生物的治理方法。如：翻土、熱處理、電滲、吸附法、土壤淋洗等。生物修復法是近幾年發(fā)展起來的，有微生物和植物兩部分。由于不同作物種類或品種對重金屬的吸收能力可以相差1010000倍。因此，在污染土壤的改良和利用方面，篩選出對重金屬有較高

9、吸收率的植物，利用植物對重金屬的超富集作用，是一種較便宜且方便的作法。利用植物吸收重金屬減少環(huán)境污染，一些植物對重金屬有較高的吸收率，連續(xù)多年種植可減少土壤中重金屬的含量，但關鍵是發(fā)現(xiàn)合適的植物。而國內外已見報道的重金屬超富集植物已有480多種，得到廣泛認同的cu超富集植物只有四十左右種4。在國外，ebbs等在1997年研究發(fā)現(xiàn)，印度芥菜是一種很有潛力的特別適合zn、cd、cu、pb 中等污染土壤修復的植物；而baker等發(fā)現(xiàn)，他們的盆栽試驗也證明該植物有很強的吸收、轉運和積累zn、cd 能力等等；在國內，束文圣5等2001年在湖北銅綠山調查發(fā)現(xiàn)鴨跖草是cu的超富集植物。其它還有典型的有酸模、

10、海州香薷等等。李君6等研究cu、pb污染土壤對馬蹄金葉片的生理指標影響效果不明顯。但是，對于能源植物在銅污染土壤中的修復能力研究鮮有報道，僅見王國慶7等研究紅麻在水培營養(yǎng)液中對cu 的吸收和富集效應，發(fā)現(xiàn)紅麻有可能實現(xiàn)對輕度cu污染土壤的植物穩(wěn)定和吸取修復。銅對能源植物麻瘋樹脅迫的生理研究還未見報道。麻瘋樹（jatropha curcas l.），又名小桐子、膏桐等，為大戟科，麻風樹屬。屬多年木生本油料植物。近些年又發(fā)現(xiàn)其種子含油量高，是制造生物柴油的首選，是世界公認的生物能源樹。現(xiàn)在是國際上研究最多的能生產(chǎn)生物柴油的能源植物之一。而能源植物是經(jīng)專門種植，含糖類(碳氫化合物)較高，用于提供能源

11、原料的草本和木本植物。如：續(xù)隨子、綠玉樹、麻瘋樹、西谷椰子、紅麻、巴西橡膠樹等。因此，研究能源植物麻瘋樹在重金屬銅環(huán)境中的生長生存情況，對于麻瘋樹在重金屬銅污染地區(qū)改善土壤環(huán)境，增加經(jīng)濟價值有重要意義。本文通過麻瘋樹幼苗銅脅迫模擬試驗，探索麻瘋樹在銅脅迫環(huán)境中的生長情況，對其形態(tài)及生理進行研究，為減少重金屬的危害，解決重金屬污染找到更有效的植物，為生物能源植物在礦區(qū)中進行污染修復提供一定參考依據(jù)。2.材料與方法2.1 材料2.1.1 植株種子麻瘋樹種子：江蘇沐陽種子發(fā)展公司。2.1.2 實驗儀器電熱恒溫鼓風干燥箱（dhg9246a，上海精宏實驗設備有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（dnp9082型，

12、上海精宏實驗設備有限公司），實驗室ph計（fe20/el20，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），分光光度計（wfj722型，龍尼柯上海儀器有限公司），超低溫離心機（eppendrof centrifuge 5810r,germany)，電子天平（pl202-s型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），游標卡尺（桂林量具刃具廠）。2.1.3 實驗藥品硫酸銅（cuso4）；四水硝酸鈣（ca(no3)24h2o）；硝酸鉀（kno3）；硝酸銨(nh4no3)；磷酸二氫鉀（kh2po4）；硫酸鎂（mgso4 /mgso47h2o）；七水硫酸亞鐵（feso47h2o)；三氯乙酸

13、（c2hcl3o2）；乙二胺四乙酸二鈉（c10h14n2na2o82h2o）；硫代巴比妥酸（c4h4n2o2s）；碘化鉀ki；硼酸（h3bo3）；硫酸錳（mnso4）；硫酸鋅（znso47h2o）；鉬酸鈉（na2moo4）；硫酸銅（cuso4）；氯化鈷（cocl26h2o）；葡萄糖（c6h12o6）；濃硫酸（h2so4）；蒽酮（c14h10o）；無水乙醇（c2h6o）；丙酮（c3h6o）。2.1.4 培養(yǎng)液及培養(yǎng)基質完全培養(yǎng)液采用霍格蘭培養(yǎng)液。配制方法如下：硝酸鉀（kno3）506mg/l，四水硝酸鈣（ca(no3)24h2o）945mg/l，硝酸銨(nh4no3)80mg/l，磷酸二氫鉀（k

14、h2po4）136mg/l ，硫酸鎂（mgso47h2o），493mg/l，鐵鹽溶液2.5ml，微量元素液5ml，ph=6.0。鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵（feso47h2o）2.78g，乙二胺四乙酸二鈉（c10h14n2na2o82h2o） 3.73g，蒸餾水500ml，ph=5.5。微量元素液：碘化鉀（ki） 0.83mg/l，硼酸（h3bo3）6.2mg/l，硫酸錳（mnso4）22.3mg/l，硫酸鋅（znso47h2o）8.6mg/l，鉬酸鈉（na2moo4）0.25mg/l，硫酸銅（cuso4）0.025mg/l，氯化鈷（cocl26h2o）0.025mg/l。銅離子溶液用硫酸銅來配置

15、。種子培養(yǎng)基質為（草炭：珍珠巖=3:2），種子萌發(fā)后移植到培養(yǎng)袋，基質為經(jīng)過粗篩的黃土。2.2 方法2.2.1 種子的萌發(fā)實驗挑選外觀飽滿、沒有發(fā)霉的種子，種植到基質為（草炭：珍珠巖=3:2）的育苗盤中待萌發(fā)，澆足水。一星期之后每天澆水，四天后第一株種子萌芽，兩周后左右全部萌芽8。2.2.2 幼苗的前期培養(yǎng)挑選生長良好的麻瘋樹幼苗，移植到培養(yǎng)袋中。培養(yǎng)基質為黃土。對所有幼苗進行完全培養(yǎng)液澆灌，四天后再次進行澆灌培養(yǎng)。對幼苗進行潑澆多菌靈，滅除菌害，液體為1:1000。2.2.3 銅離子脅迫培養(yǎng)待麻瘋樹幼苗生長穩(wěn)定后，挑選長勢相似的幼苗分組進行重金屬銅脅迫培養(yǎng)。將挑選出來的麻瘋樹幼苗分為六組，每

16、組十株，以后進行銅離子的脅迫培養(yǎng)，重復3次試驗。銅脅迫梯度設置：0、10、20、50、100、150（mg/l）。2.2.4 指標測定2.2.4.1 外部形態(tài)指標的測定各外部形態(tài)指標（莖圍，株高，葉片長寬）在進行銅脅迫培養(yǎng)的60天內，每隔20天對麻瘋樹幼苗進行外部形態(tài)指標（莖圍、株高、葉片長寬）的測量。莖圍的測量部位為土壤以上2厘米處，株高的測量部位為土壤以上部分到頂芽的高度，葉片則測量各植株的同側上部葉。2.2.4.2 生理生化指標的測定各生理生化指標測定分為春、秋兩季兩次采樣，秋季采樣：分組脅迫的60天之后；春季采樣：停止脅迫120天再次脅迫30天后。丙二醛的測定分別稱取各個脅迫組的麻瘋樹

17、葉片1g，加入少許石英砂和2ml10%tca（10%三氯乙酸），研磨成勻漿再加3ml10%三氯乙酸進一步研磨，勻漿在4000r離心10min，上清液為mda提取液，采用硫代巴比妥酸法進行顯色反應，之后進行分光光度測定在532nm和450nm下的od值，重復三次測定。并根據(jù)公式計算幼苗植株中mda含量9。葉綠素的測定采用浸提法，分別隨機取各個脅迫組的麻瘋樹葉片洗凈晾干之后稱取0.2克，剪碎放到25ml的容量瓶中，加入丙酮-乙醇混合液（體積比1:1）定容，之后放入恒溫箱中在40下浸提24小時，之后取出進行分光光度測定在645nm和663nm下的od值，重復三次測定。并根據(jù)公式計算出幼苗葉片中的葉綠

18、素的含量10。可溶性糖含量測定 取各脅迫組的麻瘋樹葉片，洗凈晾干，之后在110烘箱烘15min，然后調至70過夜。干葉片磨碎后稱取50mg樣品倒入10ml刻度離心管內，加入4ml80%酒精，置于80水浴中不斷攪拌40min，離心，收集上清液，其殘渣加2ml80%酒精重復提取2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80脫色30min，定容至10ml，過濾后，取提取液1ml，加入5ml蒽酮試劑混合，沸水浴煮10min，取出冷卻。在625nm處測其od，重復三次測定。從標準曲線上得到提取液中糖的含量9。3.結果與分析3.1 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗外部形態(tài)的影響3.1.1 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗

19、莖圍生長的影響從表1中可看出，在銅脅迫麻瘋樹幼苗后的0天到20天、40天到60天，處理組的莖圍變化量均低于對照組，而對照組在40天到60天增長0.202cm，大于20天到40天增長的0.151cm。在20 天到40天左右處理組增長又高于對照組。總體上是隨著銅離子含量的增加莖圍生長變慢。而在同一脅迫濃度下，增長逐漸緩慢，脅迫組較之對照組增長趨勢變慢更明顯。說明，經(jīng)銅離子脅迫培養(yǎng)后，對麻瘋樹幼苗的莖圍生長有抑制，時間越長，影響越明顯，隨著銅離子濃度的增加，麻瘋樹幼苗莖圍生長趨勢相對變慢。表1 銅離子對麻瘋樹幼苗莖圍的影響cu2+濃度（mg/l）每20天莖圍的生長變化情況（cm）020天2040天4

20、060天00.3360.1510.202100.3200.1630.096200.3290.1990.139500.3180.1730.0621000.2720.1480.0571500.2450.1340.0573.1.2 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗株高生長的影響由表2可以看出，經(jīng)銅離子脅迫培養(yǎng)后的麻瘋樹幼苗，在5 種不同銅濃度處理下，處理組與對照相比都受到了明顯的抑制，株高都有不同程度的下降，且隨著脅迫時間的增加，麻瘋樹幼苗的株高處理組較之對照組增長逐漸變慢。而隨著銅離子濃度的增加，株高的生長變化沒有明顯變化規(guī)律。表2 cu2+脅迫對麻瘋樹幼苗株高的影響cu2+濃度（mg/l）每20天株高的生

21、長變化情況（cm）020天2040天4060天02.8131.1570.610101.4570.9600.313201.0470.5230.453501.4570.8200.2531001.9270.8030.2101502.2200.9730.2373.1.3 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗葉片的生長影響從表3中可看出，從中可以看出，經(jīng)銅離子脅迫后的麻瘋樹幼苗，在前40天內，各處理組與對照組間麻瘋樹幼苗葉面積沒有明顯差異，但40天到60天之中，變化情況比較明顯，處理組的葉片增加量較低，而對照組葉片增加量依舊較大。而在各銅離子脅迫組季節(jié)性落葉比對照組的提前了15天左右。cu2+150mg/l脅迫培養(yǎng)的

22、麻瘋樹幼苗落葉最多，變化最為明顯。表3 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗葉面積的影響cu2+濃度（mg/l）葉片（長寬）的生長變化情況（cm2）020天2040天4060天00.330.120.120.180.750.44100.441.350.331.260.010.32200.491.480.041.370.200.39500.341.020.021.180.120.191000.181.210.350.990.040.191500.140.610.390.960.250.353.2 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗生理生化的影響3.2.1 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗中丙二醛（mda）含量的影響從圖1中可看出，脅

23、迫組葉片中丙二醛含量隨著銅離子濃度增加，在秋季呈現(xiàn)遞增的趨勢，而春季除在銅離子20mg/l脅迫組之外，也呈現(xiàn)遞增趨勢。且均比對照組的高，說明隨著銅離子濃度的增加，銅離子對麻瘋樹幼苗的細胞傷害越來越大。而春、秋兩季比較，春季各組分丙二醛含量比較低，但在銅離子10mg/l時春季大于秋季。；丙二醛在銅離子濃度150mg/l時，是整個組的最高值，春季丙二醛含量最高值是對照組的1.7倍，秋季最高值是對照組的1.8倍。圖1 銅離子對春、秋兩季麻瘋樹幼苗丙二醛含量的影響3.2.2 銅離子脅迫對麻瘋樹幼苗中葉綠素a、b、總葉綠素含量的影響從cu 處理后葉片的葉綠素含量動態(tài)變化中可以看出,不論是春季還是秋季，脅

24、迫組葉綠素a、b、葉綠素總量全部低于對照組，這一結果說明銅離子會抑制麻瘋樹幼苗中葉綠素的合成，從而降低光合作用，限制麻瘋樹幼苗的生長。且隨著銅離子濃度的增加，脅迫增強，葉綠素a、b、葉綠素總量大體上呈下降趨勢。再從春、秋兩季的對比中可以看出，春季中葉片的葉綠素含量明顯大于秋季，春季麻瘋樹幼苗生長較旺盛，銅離子在春季的影響較之秋季差別較大。在春季在受脅迫組的葉綠素含量最低值有對照組的69.9%；而秋季只有對照組的40.3%。春季光合作用強度較大（圖2）。圖2 銅離子對春、秋兩季麻瘋樹幼苗葉綠素a、b葉綠素總含量的影響3.2.3 銅離子對麻瘋樹幼苗中可溶性糖的影響從圖3中可看出，經(jīng)銅離子脅迫培養(yǎng)后

25、的麻瘋樹幼苗，葉片中可溶性糖含量均比對照組的低。就春、秋兩季葉片中的可溶性糖相比較，大體上春季中明顯多于秋季。這說明銅離子影響了葉片中可溶性糖的合成，而春季中植株生命相對旺盛，銅離子脅迫相對較弱。圖3 銅離子對春、秋兩季麻瘋樹幼苗可溶性糖含量的影響4.討論麻瘋樹的莖圍、株高、葉面積是外部形態(tài)的重要觀測指標，直觀的反映了植株的長勢情況。試驗中，各處理組莖圍總體上是隨著銅離子含量的增加生長變慢。在同一脅迫濃度下，隨著脅迫時間延長，生長逐漸緩慢。說明經(jīng)銅離子脅迫培養(yǎng)后，麻瘋樹幼苗的莖圍生長受到抑制，時間越長，影響越明顯，隨著銅離子濃度的增加，麻瘋樹幼苗莖圍生長趨勢變慢。在5 種不同銅濃度處理下，株高

26、都有不同程度的下降，且隨著脅迫時間的增加，麻瘋樹幼苗的株高較之對照組增長逐漸變慢。說明銅脅迫對麻瘋樹幼苗的株高生長有抑制作用。這與周宏利11等所做銅脅迫對蔬菜幼苗株高的影響結果相似。經(jīng)銅離子脅迫處理后，麻瘋樹幼苗葉片的生長與對照組相比均無明顯差異，而在150mg/l的銅離子脅迫培養(yǎng)下對麻瘋樹幼苗葉片的生長影響較大。處理組與對照組相比，葉片的落葉期明顯提前15天左右，而長出新葉的時間晚了20天左右。這可能是銅脅迫造成植株生長不良，養(yǎng)分輸送受阻；也可能是銅離子使植株抗逆性減弱，而植株根據(jù)自己的需要提高自身抗性的行為。丙二醛(mda)的積累來自不飽和脂肪酸的降解,它的生成是植物體內自由基引發(fā)而產(chǎn)生的

27、,mda的積累能夠反映植物體內自由基的活動狀態(tài)。因此,在植物逆境生理研究中,mda被普遍地作為一種表示傷害的指標12。試驗結果表明：脅迫組葉片中丙二醛含量隨著銅離子濃度增加，在秋季呈現(xiàn)遞增的趨勢，而春季除銅離子20mg/l脅迫組之外，也呈現(xiàn)遞增趨勢，且均比對照組的高；春、秋兩季所得數(shù)據(jù)比較，同一濃度下，春季麻瘋樹幼苗的葉片中丙二醛含量較低。說明隨著銅離子濃度的增加，銅離子對麻瘋樹幼苗的細胞傷害越來越大。而春、秋兩季比較，春季各組分丙二醛含量對較低，但銅離子在10mg/l時麻瘋樹幼苗的丙二醛含量春季大于秋季。丙二醛含量在銅離子濃度150mg/l時，是整個組的最高值，春季丙二醛含量最高值是對照組的

28、1.7倍，秋季最高值是對照組的1.8倍。李淑艷13等在重金屬銅、鋅脅迫對黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響一文中的重金屬銅、鋅脅迫對黃瓜幼苗丙二醛（mda）含量的影響也得到類似結論。葉綠素含量是測定植物光合作用的重要指標之一。本次試驗，不論是春季還是秋季，脅迫組葉綠素a、b、葉綠素總量全部較對照組低，且隨著銅離子濃度的增加，脅迫增強，葉綠素a、b、葉綠素總量大體上呈下降趨勢。這與刁豐秋14等得出的結果相似。王廣林15等研究的銅、鉛脅迫丁香蓼中的脅迫組葉綠素含量也全部低于對照組。原因可能在于吸收的銅離子作用于葉綠素生物合成途徑的幾種酶的肽鏈結構,從而抑制酶的活性,阻礙葉綠素的合成。再從春、秋兩季的對比

29、中可以看出，春季中葉片的葉綠素含量明顯大于秋季，春季麻瘋樹幼苗生長較旺盛，銅離子在春季的影響較之秋季差別較大。在春季在處理組的葉綠素含量最低值為對照組的69.9%；而秋季只有對照組的40.3%。說明春季植株光合作用相對較強。結果證明：銅離子會抑制麻瘋樹幼苗中葉綠素的合成，降低光合作用，限制麻瘋樹幼苗的正常生長。銅離子脅迫后的麻瘋樹幼苗體內的可溶性糖與對照組相比，含量均低于對照組。春、兩季比較，同一濃度下，春季植株葉片中可溶性糖含量普遍大于秋季植株葉片內的內可溶性糖含量。可能由于受到春、秋兩季氣候影響了植株的正常生長。所以說，銅離子影響了麻瘋樹幼苗葉片中可溶性糖的產(chǎn)生，影響了植株的正常生長代謝。

30、王衛(wèi)紅3等在赤紅壤施用cuzn對菜心生長和吸收cuzn的影響中也得到相似的結果。結果證明：銅離子脅迫后的麻瘋樹幼苗體內的可溶性糖的合成均受到了不同程度的抑制。5.結論本次試驗表明，銅脅迫對麻瘋樹幼苗的生長株高、莖圍、均產(chǎn)生了不同程度的抑制，長時間的銅脅迫培養(yǎng)下，葉片增長緩慢，植株的生長發(fā)育有所影響。銅脅迫影響了麻瘋樹幼苗的葉綠素、可溶性糖合成，使之含量降低；且隨著銅離子濃度的增加，丙二醛的含量也隨之增大，使麻瘋樹幼苗的抗逆性變弱。在生長旺盛季節(jié)，銅離子對麻瘋樹幼苗的毒害相對較弱。通過試驗記錄所知，受脅迫的植株相對正常植株落葉較早（15天左右），而長新葉又相對較遲（20天左右）。綜上所述，預測在