1、第二講 沉淀分離技術 2 學時 、通過本章學習應掌握的容 1、什么是沉析？ 2、沉析法純化蛋白質的優點有哪些？ 3、沉析的一般操作步驟是什么？ 4、何謂鹽析？其原理是什么？ 5、鹽析操作時常用的鹽是什么？ 6、影響鹽析的主要因素有哪些？ 7、有機溶劑沉析法的原理是什么？ 8、影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些？ 9、等電點沉析的工作原理是什么？ 10、其它常用的沉析方法有哪些？ 、沉淀分離的目的及其方法 沉淀分離技術是經典的化學分離技術。 沉淀的概念是指溶液中的介質在適當 條件下由液相變成固相而析出的過程。 沉淀技術的目的包括兩個：通過沉淀使目標成分達到濃縮和去雜質的目 的。當目標成分是以固相形

2、式回收時，固液分離可除去留在溶液中的非必要 成分；如果目標成分是以液相形式回收時，固液分離可使不必要的成分以沉 淀形式去除。通過沉淀可使已純化的產品由液態變成固態，有利于保存和 進一步的加工處理。 沉淀分離技術通常包括下列各種沉淀方法： 無機沉淀劑沉淀分離法：通常是以鹽類作為沉淀劑的一類沉淀方法，如鹽 析法，多用于各種蛋白質和酶類的分離純化，以及某些金屬離子的去除。常 用的沉淀劑有：硫酸銨、硫酸鈉、檸檬酸鈉、氯化納等。 有機沉淀劑沉淀分離法：以有機溶劑作為沉淀劑的一種沉淀分離方法， 多用于生物小分子、多糖及核酸類產品的分離；有時也用于蛋白質的沉淀和 金屬離子的去除；用于酶的沉淀分離時，易導致酶

3、的失活。常用到的沉淀劑 有：丙酮、乙醇、甲醇等。 非離子多聚體沉淀劑沉淀分離法： 采用非離子型的多聚體作為目標成分的 沉淀劑，適用于生物大分子的沉淀分離，如酶、核酸、蛋白質、病毒、細菌 等。典型的非離子型多聚體是聚乙二醇（ PEG），根據其相對分子量的大小， 有 PEG600、PEG4000、 PEG20000等型號。 等電點沉淀法： 主要是利用兩性電解質在等電點狀態下的溶解度最低而沉 淀析出的原理。適用于氨基酸、蛋白質及其它屬于兩性電解質組分的沉淀分 離，如大豆蛋白“堿提酸沉”的提取方法。 共沉淀分離法：又可稱為生物鹽復合物沉淀法，用于多種化合物特別是一 些小分子物質的沉淀。 它是利用沉淀的

4、同時對其它待分離成份吸附共沉淀而 達到除雜的目的。 變性沉淀分離法：又稱為選擇性變性沉淀法，是利用特定條件使目標成分 變性，導致其性質的改變如溶解度下降而得以分離。適用于一些變性條件下 差異較大的蛋白質和酶類的分離純化。采取的變性條件有 pH 值、溫度的改 變以及添加劑、利用酶的作用等，腐竹的生產是利用大豆蛋白的熱變性而進 行分離的一個例子。 二、沉析的特點 操作簡單、經濟、濃縮倍數高，但針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性 不強。 三、沉析操作的一般過程 1、在經過濾或離心后的樣品中加入沉析劑； 2、沉淀物的化，促進晶體生長； 3、離心或過濾，收集沉淀物； 四、無機沉淀劑沉淀分離法 一些金屬

5、離子的各種鹽類形式，如硫酸鹽、碳酸鹽、草酸鹽等，其溶解度 都很小。所以，當添加適當的無機沉淀劑形成上述各種化合物時，便會形成 沉淀，使金屬離子得以分離；另外，大部分蛋白質等生物大分子都可以通過 在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程稱為“鹽析” 。這節重點介紹鹽 析法。 2.1 鹽析法 鹽析分離法應用最早和最廣泛的是在蛋白質和酶類的分離工作中， 用鹽析法 分離蛋白質已有 80 多年的歷史。由于其它分離技術的出現，鹽析法在選擇 性方面顯得有些不足，但是在粗提純階段，鹽析法至今仍普遍得到應用 2.1.1 鹽析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在狀態： （1）兩性電解質，由于靜電力的作用，分

6、子間相互排斥，形成穩定的分散 系 （2）蛋白質周圍形成水化膜，保護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞 3、鹽析過程 當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現以下兩種情況： （1） “鹽溶”現象在低鹽濃度下，蛋白質和酶類的溶解度隨著隨著鹽的濃 度提高而增大，這個過程稱為鹽溶。這主要是中性鹽離子對蛋白質分子表面 活性基團及水活度的影響： a）無機鹽離子在蛋白質表面上吸附，使顆粒帶相同電荷而互相排斥。 b）無機鹽離子增加了蛋白質的親水性，改善了與水膜的結合，增加了蛋 白質分子與溶劑分子相互的作用力，使蛋白質的溶解度增加。 （2）“鹽析”現象高鹽濃度下，蛋白質溶解度隨之下降，原因如下： （a）無機離子與蛋白質表

7、面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質的 電性，使蛋白質分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏； （b）中性鹽的親水性大，使蛋白質脫去水化膜，疏水區暴露，由于疏水區 的相互作用導致沉淀； 在鹽析過程中，蛋白質的溶解度與溶液中鹽的離子強度之間的關系可用 Cohn 表達式表示： lg（S/S0） = - KsI 或lgS = lgS0 - KsI 式中： S0蛋白質在純水中（ I=0）的溶解度； S蛋白質在離子強度為 I 的溶液中的溶解度； Ks鹽析常數； I 離子強度。 其中離子強度 I=1/2Mz 2, M 表示溶液中各種離子的物質的量濃度， z 為各 種離子的價數。當溫度一定時，對于某一溶

8、質來說，其 S0也是一常數，即 lgS0 = （截距常數），所以有 lgS =- K sI。值的大小取決于溶質的性質，與溫 度和 pH 值有關。 Ks 取決于鹽的性質，并且與離子的價數、平均半徑有關。一般來說，溶質的 K s值越大，鹽析的效果越好；同一溶液中，兩種溶質的 Ks 值相差越大，則 鹽析的選擇性就越好。 表 2-1 列舉了一些蛋白質用不同的鹽類進行鹽析時的 Ks 值。一般來說，高 價陰離子如硫酸根、磷酸根等有較高的 Ks 值，而高價陽離子如鎂離子、鈣 離子等，則會有較低的 Ks值。至于蛋白質的性質與 Ks 值之間的關系，目前 還沒有明顯的規律可尋，也沒有適當的理論加以詳述。 2.1.

9、2 鹽析分離中鹽的選擇 在蛋白質的鹽析中，以硫酸銨、硫酸鈉應用最廣。雖然磷酸鹽的鹽析效果 比硫酸銨好，但硫酸銨的最大優點是溫度系數小，溫度的變化引起溶液性質 的改變不大，且其溶解度大，應用于許多蛋白質和酶的鹽析時，對蛋白質和 酶變性的影響較小，并且硫酸銨價格低廉。硫酸銨用于蛋白質鹽析時，最大 的缺點是除了緩沖能力較小外，還由于含氮，影響蛋白質的定量分析，尤其 是采用凱氏定氮法和雙縮脲法進行測定時。 硫酸鈉由于不含氮， 因此不影響蛋白質的定量測定， 但其缺點是在 30以下 溶解度太低，需在 30 以上操作效果才好，不利于保持酶的活性。磷酸鹽、 檸檬酸鈉等也用于蛋白質的鹽析，但由于溶解度低，或容易

10、與其它金屬離子 產生沉淀，或因酸性過強，都不如硫酸銨的應用那樣廣泛。 4、離子強度對鹽析過程的影響 log S KsI Cohn 經驗公式 S 蛋白質溶解度， mol/L; 12 I 2 ci Zi I離子強度 c:離子濃度； Z：離子化合價 鹽濃度為 0時，蛋白質溶解度的對數值。與蛋白質種類、溫度、 pH 值有 關，與鹽無關； Ks鹽析常數，與蛋白質和無機鹽的種類有關，與溫度、 pH值無關。 Ks鹽 析法：在一定 pH 和溫度下，改變體系離子強度進行鹽析的方法； 鹽析法：在一定離子強度下，改變 pH 和溫度進行鹽析； 其中，Ks 鹽析法由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現 象，

11、因此常用于提取液的前處理。 而鹽析法由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常 用于初步的純化。 5、鹽析用鹽的選擇在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有 一定差異，一般的規律為： 半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱 Ks）磷酸鉀 硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉 硫酸鎂 選用鹽析用鹽的幾點考慮： （1）鹽析作用要強 （2）鹽析用鹽需有較大的溶解度 （3）鹽析用鹽必須是惰性的 （4）來源豐富、經濟 6、常用的鹽析用鹽 #硫酸銨：溶解度大（ 767g/L） 硫酸鈉 磷酸鹽 檸檬酸鹽 7、影響鹽析的因素 （1）溶質種類的影響： Ks 和值 （2）溶質濃度的影響：蛋

12、白質濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分 辨率低；蛋白質濃度小，鹽的用量大，分辨率高； （4）pH值：影響蛋白質表面凈電荷的數量，通常調整體系pH 值，使其在 pI 附近； （5）鹽析溫度：大多數情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下 降； 蛋白質濃度的影響 對溶液中各種蛋白質進行分步分離時，各種蛋白質濃度不同，硫酸銨的用量 差別也較大。蛋白質濃度高時，鹽的用量減少。但如果各種蛋白質的 Ks 值 比較接近，則會發生比較嚴重的共沉作用，使鹽析分離的選擇性下降。蛋白 質濃度過低時，鹽的用量增大，但共沉作用較小，選擇性較好。溶液中的蛋 白質濃度為 2.5%-3.0% 時進行鹽析，效果比較好。

13、 離子強度和離子類型的影響 對于同一類的蛋白質，隨著溶液中離子的強度由低而高的變化，蛋白質也 隨之發生由鹽溶而至鹽析的變化過程。對于不同類型的蛋白質，鹽析時所要 求的離子強度各有不同。用鹽析法分離多種蛋白質時，總是采用低的離子強 度分離出一種蛋白質，然后再逐漸增加離子強度，分離出第二種、第三種乃 至更多種蛋白質，這就是分步鹽析法。運用此法時，各種蛋白質的 Ks 值差 別越大，效果越好。 不同離子類型對鹽析效果的影響 通常認為離子半徑小、帶較高電荷的離子鹽析效果較好；離子半徑大，帶 低電荷的離子鹽析效果差。 如單價鹽 KCl、NaCl 的鹽析效果就較差。 不同離 子的這種差異，常用其對應于蛋白質

14、的鹽析常數 Ks 值的差別來表示， Ks值 越大，鹽析效果越好。各種鹽類的 Ks 差別可用下列順序表示：磷酸鉀硫 酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂。 pH 值對鹽析效果的影響 屬于兩性電解質的分子，如蛋白質、酶及氨基酸等，其溶解度與所帶的電 荷有關。當其分子所帶的正負電荷為零時，分子處于等電狀態，此時溶液的 pH 值即為該分子的等電點。處于等電點的兩性分子，溶解度最小；偏離等 電點的兩性分子，溶解度較大。因此在鹽析時，一般選擇在兩性分子的等電 點處的 pH 值下進行，以獲得最佳的鹽析效果。 溫度的影響 在低離子強度下，蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大；在高離子強度 下，則隨著溫度的升高而下降。對于蛋

15、白質來說，鹽析對溫度的要求不是很 嚴格，通常是在常溫下進行操作。但是對于酶類，由于其大部分對溫度都比 較敏感，因此對于酶類鹽析時應在較低溫度下操作，以最大限度地保持酶的 活性。 2.1.4 鹽析后的脫鹽處理 常用的脫鹽處理有：透析法、電滲析法和葡聚糖凝膠過濾法。這里簡單介紹 一下透析技術。 廣義地說，透析也是一種膜分離技術。用于透析的膜是一種半透膜，即具有 讓小分子和水擴散而不斷地通過，直到膜外濃度達到平衡；而大分子則不能 透過膜而被截留在膜側的一種膜。生物的細胞膜、羊皮紙、火棉膠、玻璃紙 以及賽璐玢等即屬于半透膜。用于透析的膜，必須具有如下特點： 只允許小分子溶質和溶劑通過，大分子不能通過；

16、 具有化學惰性，與溶質不起化學作用，在水、鹽、稀酸、堿中不溶解； 有一定的機械強度和良好的再生性能。 透析的方法比較簡單。實驗室少量樣品可放入做成的透析袋，并留出一般左 右的體積，然后扎緊袋口，懸掛于盛有純凈溶劑的大容器，即可透析。透析 過程過攪拌和不斷更新新鮮溶劑，可大大提高透析效果。 2.1.5 硫酸銨飽和度的調整方法 硫酸銨使用前的預處理 用一般生化工業制備的硫酸銨即可， 如果待鹽析的蛋白質和酶的活性中心含 巰基，如菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶等屬于巰基蛋白酶類的制品， 則需預處理， 去除硫酸銨中的重金屬離子，以消除其對酶活性的影響。方法是將硫酸銨配 成濃溶液，然后通入 H2S 氣體至飽和。放

17、置過夜后用濾紙濾除重金屬沉淀 物，濾液在瓷蒸發器中濃縮結晶，再在 100 下干燥即可使用。 硫酸銨飽和度的調整 當鹽析要求飽和度高而又不宜增大溶液的體積時，可直接加入硫酸銨的 固體鹽，不同的飽和度應加入的硫酸銨用量可查閱相關的分析手冊。當鹽 析要求的飽和度不高，又必須防止局部濃度過高時，通常是采用加入飽和硫 酸銨溶液法。 鹽析時要求的飽和度以及所需加入飽和硫酸銨溶液體積的計算如下： V=V 0(S2-S1)/(1-S 2) 式中： V 需加入飽和硫酸銨溶液的體積； V0 待鹽析溶液的體積； S1 原來溶液的硫酸銨飽和度（第一次鹽析時通常為 0 ）； S2 需達到的硫酸銨飽和度。 25oC 時，

18、硫酸銨的飽和溶解度是 767g/L，定義為 100%飽和度 .3 影 響鹽 析效 果的因 素 2.3 有機沉淀劑沉淀分離法 1、概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解 度，使其沉淀析出。 2 原理： （ 1）降低了溶質的介電常數， 使溶質之間的靜電引力增加， 從而出現聚集現象， 導致沉淀。 (2)由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質表面水 化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。 3、常用的有機溶劑沉析劑 沉淀金屬離子的有機沉淀劑：主要包括生成螯合物的有機沉淀劑、生成離 子締合物的有機沉淀劑以及生成三元絡合物的有機沉淀劑。 沉淀有機成分的有機沉

19、淀劑：可以沉淀水溶液中氨基酸、蛋白質、酶、核 酸、多糖、果膠以及其它生化小分子的沉淀劑包括：乙醇、甲醇、丙酮、二 甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈、異丙醇等，其中最常用的是乙醇和丙酮。 V=V 0(S2-S1)/(1-S 2) 式中： V 需加入有機沉淀劑的體積； V0 原溶液的體積； S1 原溶液中有機沉淀劑的濃度； S2 需達到的有機沉淀劑濃度。 乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子 的沉析； 丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用圍不廣； 特點：介電常數小， 60%乙醇的介電常數是 48 丙酮的介電常數是 22 容易獲取 4、有機溶劑沉析的特點 1）分辨

20、率高；即一定濃度的有機沉淀劑只沉淀分離某一種或某一類溶質組分 2）溶劑容易分離，并可回收使用； 3）產品潔凈； 沉淀后所得產品不需脫鹽， 殘留的沉淀劑通過揮發而易于去除 4）有機沉淀劑的缺點是容易使蛋白質等某些具有生物活性的生物大分子失活； 5）應注意在低溫下操作； 6）成本高 5、溶劑選擇 1）介電常數要小 2）致變性作用要小（甲醇） 3）毒性要小、揮發性適中 4）水溶性要好 6、影響有機溶劑沉淀效果的因素 （4） 2.3.2 影響 金屬離子的助沉析作用： Zn2+、Ca2+ 當溶液中有一些金屬離子存在時，能降低大分子溶質的溶解度，同時不影響 目標成分的生物活性，可使有機溶劑的用量減少，這在

21、工業上有實用價值， 如 Zn 2+ 、Ca2+ 、在一定的 pH 值條件下能與呈陰離子狀態的蛋白質形成復 合物，這種復合物在水和有機溶劑中的溶解度明顯降低。 鹽濃度的影響 溶液中鹽的濃度太大或太小，對沉淀都有不良影響。沉淀蛋白質和多糖時， 有機溶劑中鹽的濃度以不超過 5% 為宜。 樣品濃度： 0.52% 稀：溶劑用量大，回收率低，但共沉淀作用小 濃：節省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低 溶質相對分子質量與有機溶劑用量的影響 一般來說，待分離組分的相對分子質量越小，有機溶劑的用量越多。不同濃 度的有機溶劑能使溶質中不同的組分先后沉淀，因而能起到分步沉淀的效 果。 溫度的影響 在有機溶劑存在時，蛋白

22、質的溶解度隨著溫度的降低而降低。一些具有生物 活性的生化成分，如蛋白質、酶、核酸等，對溫度變化較為敏感。溫度升高 時，容易發生變性。因此為了盡可能地保存制品的生物活性，應盡量采用低 溫操作。低溫對于提高沉淀效果也比較有利。 總之，低溫有利于防止溶質變性；有利于提高收率（溶解度下降） ； pH 值的影響 像酶、蛋白質、氨基酸等大多屬于兩性電解質物質，因此選擇其等電點處的 pH 值，可最大限度地進行沉淀。在一定的有機溶劑濃度下，改變 pH 值， 就可以進行有選擇的分段沉淀，用以分離不同的組分。 攪拌速度：散熱 6）離子強度：離子強度低有利于沉析， 0.010.05mol/L 2.4 等電點沉淀分離法 2.4.1 等電點沉淀分離的基本原理 等電點沉淀分離法主要是利用兩性電解質分子在電中性時溶解度最低， 不同 蛋白質是多價的兩性電解質，通常在偏酸性溶液中帶正電，在偏堿性溶液中 帶負電，在其等電點處的靜電荷為零， 因而容易相互聚集成為較大的