1、蛋白純化A KT A操作說明AKTA pure操作說明分子篩層析操作步驟：1 開機(jī)：打開AKTA pure開尖，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音）。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊Unicorn 7.0打開系統(tǒng)，進(jìn)入log on界面，用戶名默認(rèn)為Default，輸入密碼:default，點(diǎn)ok鍵,出現(xiàn)提示對(duì)話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系 統(tǒng)。注意：進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)會(huì)彈出三個(gè)界面：System Control界面，Evaluation界面 和Administration界面。其中system Control界面為主操作窗口，所有的設(shè)置 選項(xiàng)都是在該界面下完成：Man ualExecute Ma nual

2、 instructions:Evaluation界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口 ； Administration界面為Unicorn 7.0系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：把A1泵頭從20%乙醇中取出，用去離子水沖洗，放入分子篩緩沖液中，在 SystemCon trol 界面下、點(diǎn)擊 manu alExecute Manual in struct ion sPumps- PumpA wash點(diǎn)幵 in let 選擇 A1Excuse。4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓: Alamsalam systerm pressure-high alam-設(shè)置柱壓一-Execute ；設(shè)流速： PumpsSystem f

3、low -設(shè)置 system flow （1 mL/min） Execute。注意：流速和柱壓設(shè)置參照“GE蛋白純化柱表”，不要超出最高限制。5. 裝柱子（先上后下）：接柱子的上面：擰下連接進(jìn)樣閥和檢測(cè)器之間的線，等進(jìn)樣閥出口有液體流出 時(shí)，擰開柱上面線頭的螺帽，將它連到進(jìn)樣閥出口；接柱子的下面：去掉柱下端連接的注射器，連上接頭，連上一段線，待液體滴 出滴出液體滴到檢測(cè)器上的連接口的洞里，滴滿，將接頭連到 檢測(cè)器的連接口里。6. 平衡柱子：分子篩buffer平衡柱子，一般要兩個(gè)小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到5.5%左右。7. 設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命名：先 endManual instructions

4、、點(diǎn)擊 browse、彈出 select resultname&location界面、點(diǎn)開文件夾“defaultHome”，找到文件夾labdata*，點(diǎn)開，選擇自己名字首字母縮寫文件夾（已創(chuàng)建），在界面下方name”指令框進(jìn) 行命名。注意：命名時(shí)要標(biāo)明日期，柱子型號(hào)，樣品名稱。設(shè)流速：PumpsSystem flow-設(shè)流速(1 mL/min) -Execute ；設(shè)柱壓: Alams alam systerm pressure-high alam設(shè)置柱壓一點(diǎn)擊Execute；洗 A 泵：PumpsPump A wash點(diǎn)開 inlet、選擇 A1Excuse ；紫外調(diào)零：MonitorsA

5、uto zero UVExecute ；設(shè)置q攵集體積:Fracton collectionpeak fractionationfraction size設(shè)置收 集體積Execute ；一般設(shè)為1 mL （可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）。設(shè)置q攵集水平: Fracton collect ionpeak fraction ati on parameters-Start level設(shè)置起始收集水平Execute注意：對(duì)于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水 平可 設(shè)低些，如10 mAU,避免損失蛋白。8. 上樣：沖洗Loop環(huán)：取5mL注射器，吸取5 mL分子篩（不能有氣泡），從進(jìn)樣口注射2倍Loop體

6、積的分子篩來清洗Loop環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品（V 2 mL），12000 rpm離心3 min，把上清轉(zhuǎn) 移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作，首先彈出注射器內(nèi)的氣泡，隨后稍推注射器，使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致 液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入Loop環(huán) 中。Inject:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve點(diǎn)開 position 選項(xiàng)injectExecute走2倍Loop體積的分子篩緩沖液；Load:點(diǎn)擊 Flo

7、w pathinjection valve點(diǎn)開 position 選項(xiàng)一-manual load一 Execute,調(diào)回 Load 狀態(tài)。9. 收集目標(biāo)蛋白：參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，估計(jì)樣品出峰位置，收集蛋白樣品，做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop 900 停止收集。10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出來，離子濃度平衡后，點(diǎn)擊pause進(jìn)分子篩的buffer的泵頭 用去離子水洗，放入20%的乙醇中，continue洗泵（A1泵），平衡柱 子。20%的乙醇平衡柱子，一般要兩小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到0%。門.收柱子（先下后上）：調(diào)節(jié)流速至0.5 mL/min，擰下柱下面的接頭，連上注射器，

8、再調(diào)流速至1mL/min，注射器內(nèi)吸入3-5 mL 20%乙醇，取下柱上面的接頭看是不是往外流 液體，因?yàn)樽⑸淦鲀?nèi)有壓力，液體會(huì)倒流，蓋子內(nèi)滴滿液體，立即擰上蓋子， 防止進(jìn)氣泡，將進(jìn)樣閥的線接到檢測(cè)器上。12尖閉系統(tǒng)：點(diǎn)擊End尖閉系統(tǒng)界面，尖閉AKTA pure電源，尖電腦018-09-01AKTA pure操作說明離子交換蛋白純化步驟(RESOURCE Q/S )1開機(jī)：打開AKTA pure開矣，看指示燈，泵同步(泵內(nèi)有注入液體的聲音)。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊Unicorn 7.0打開系統(tǒng)，進(jìn)入log on界面，用戶名默認(rèn)為 Default,輸入密碼:default,點(diǎn)ok鍵，出

9、現(xiàn)提示對(duì)話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入 系 統(tǒng)。注意：進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)會(huì)彈出三個(gè)界面：System Control界Evaluation界面和 Administration界面。其中system Control界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選項(xiàng) 都是在該界面下完成：Ma nualExecute Ma nual instructions.；Evaluation界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口 ； Administration界面為Unicorn 7.0系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)去離子水沖洗A1,B1進(jìn)液泵頭分別放入A，B液中； 洗 B 泵： 選擇 System Control 界面 manua

10、lExecute Manual instructionsPumpsPump A wash點(diǎn)開 in let 選擇 B1Excuse ；洗 A 泵： 選擇 System Control 界面 manualExecute Manual instructioPumpsPump A wash點(diǎn)開 in let,選擇 A1Excuse,洗泵結(jié)束后調(diào) B 至 100%, OminExecute o4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓: Alamsalam systerm pressure-high alam一設(shè)置最高柱壓一-Execute 設(shè)流速： PumpsSystem flowsystem flow （ 1 m

11、L/min） execute； 注意：流速和柱壓設(shè)置參照“GE蛋白純化柱表”，不要超出最高限制。5. 安裝RESOURCE柱（先上后下）：裝離子柱時(shí)先擰開離子柱上面，連上來自進(jìn)樣閥的線，邊擰緊上面邊擰松柱下 面，在離子柱子下端出口連上轉(zhuǎn)接頭，接上一根較短的先并連到檢測(cè)器上（流 出液體，滴滿檢測(cè)器上的連接口的洞里，再擰緊）。6. 平衡 RESOURCE 柱：等 B 液平衡后、點(diǎn)擊 PumpsgradientTarget-調(diào) B 至 0% OminExecute等平衡后，記錄最高和最低鹽離子濃度：離子交換B液鹽離子濃度約為84%，離子交換A液鹽離子濃度約為1 -7%。7. 設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命名

12、：先 endManual instructions 點(diǎn)擊 browse，彈出 select result name&location界面，點(diǎn)開文件夾“defaultHome”，找到文件夾 labdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字首字母縮寫文件夾（已創(chuàng)建）在界面下方name”指令框進(jìn)行命名。注意：命名時(shí)要標(biāo)明日期，柱子型號(hào)，樣品名稱。設(shè)流速：PumpsSystem flow-設(shè)流速（1 mL/min） Execute;設(shè)柱壓: Alamsalam systerm pressure-high alarri-設(shè)置柱壓一點(diǎn)擊Execute；紫外調(diào)零：MonitorsAuto zero UVExecute

13、；設(shè)置q攵集體積:Fracton collectionpeak fractionation-fraction size設(shè)置i攵集體積Execute ；一般設(shè)為1 mL （可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）。設(shè)置q攵集水平: Fracton collect ionpeak fraction ati on parameters-Startlevel設(shè)置起始收集水平Execute注意：對(duì)于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可 設(shè)低些，如10 mAU，避免損失蛋白。8. 上樣：沖洗Loop環(huán)：取5 mL注射器，吸取5 mL分子篩（不能有氣泡），從進(jìn)樣口注射2倍Loop體積的分子篩來清洗Loop環(huán)；蛋白樣品處

14、理：取出蛋白樣品（V 2 mL），12000 rpm離心3 min，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作，首先彈出注射器內(nèi)的氣泡，隨后稍推注射器，使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致 液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入Loop環(huán) 中。Inject:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve點(diǎn)開 position 選項(xiàng)injectexecute走2倍Loop體積的分子篩緩沖液；Load:等流穿峰出來后、點(diǎn)擊Flow pathinjecti

15、on valve點(diǎn)開position選項(xiàng)- manual load-Execute,調(diào)回 Load 狀態(tài)。注意：流穿峰蛋白先別丟棄，它有可能是樣品沒有掛上柱子而直接流出來的目 標(biāo)蛋白。9洗脫目的蛋白：PumpsGradient target 50% length 50 min （可調(diào)）Execute、自離子柱上洗脫結(jié)合的蛋白10. 收集目標(biāo)蛋白：收集洗脫下來的蛋白樣品，做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop 900停止收 集。11. B液平衡離子柱：PumpsGradient target 50% length 0 minExecute,至鹽離子濃度達(dá)到最高且平衡如繼續(xù)純化其他蛋白樣品： 要用A液再平衡后再上樣，步驟同上1-11 o如不再純化其他蛋白樣品：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)去離子水