多肽類藥物的研究進展與發展方向, 多肽是一類在氨基酸構成及其連接方式上與蛋白質相同, 但在某些性質方面又有別于蛋白質的物質, 如其空間結構較簡單、穩定性較高、免疫原性較低或無免疫原性等。所有生物細胞都能合成多肽, 同時, 也受各種多肽的調節。多肽作為藥物和健康產品開發較多, 并且已經形成了一定的產業化規模。,自1953年人工合成了第一個有生物活性的多肽 催產素以后，20世紀50年代都集中于腦垂體所分泌的各種多肽激素的研究。60年代，研究的重點轉移到控制腦垂體激素分泌的各種多肽激素的研究。 70年代，神經肽的研究進入高潮。生物胚層的發育淵源關系表明，很多腦活性肽也存在于腸胃組織中，從而推動了腸胃激素研究的進展。,1 多肽藥物的主要功能及重要性,肽具有極強的活性和多樣性。肽在生物體內作為神經遞質，傳遞信息。肽在生物體內作為載體和運輸工具，將人們平常所食的營養物質輸送到人體各個部位，充分發揮營養物質功能。肽不僅能提供人體生長發育所需的營養物質，而且具有特殊的生物學功能，可防治血栓、高血脂、高血壓，延緩衰老，抗疲勞，提高機體免疫力，促進人體對蛋白質、維生素、氨基酸等營養物質和鈣、鐵、鋅、鎂、銅等多種有益的微量元素的吸收。,2 多肽類藥物的分類,按來源分生化藥物 來源于動植物有機體基因工程藥物 來源于基因工程菌表達生產的藥物習慣分法多肽生化藥物、細胞生長因子、抗體藥物、抗菌肽、酶類藥物,2.1 生化類藥物,多肽類激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘腦多肽、腦多肽、激肽等；動、植物蛋白。酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、凝血酶及抗栓酶，輔酶Q10等。,多肽類激素是機體的特定腺體合成并釋放的一種物質，通過與遠程敏感細胞內或細胞表面的受體相互作用而使靶細胞發生變化。主要包括垂體多肽激素、下丘腦多肽激素、甲狀腺多肽激素、胰島多肽激素、腸胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。,多肽類生化藥物功能特性調節各種各樣的生理活動和生化反應；生物活性高；分子小，結構易于改造；許多活性多肽都是由無活性的蛋白質前體經酶加工剪切轉化而來,2.2 基因工程藥物,激素類及神經遞質類藥物：人生長激素釋放抑制因子，人胰島素，人生長激素細胞因子類藥物：人干擾素，人白細胞介素，集落刺激因子，促紅細胞生成素酶類及凝血因子類藥物：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長因子、內啡肽、反義藥物、人生長激素、促紅細胞生成素、腫瘤壞死因子等。,2.2.1 細胞生長因子,細胞因子是多種細胞所分泌的能調節細胞生長分化、調節免疫功能、參與炎癥發生和創傷愈合等小分子多肽的統稱。大多數細胞因子作用于或產生于構成免疫與炎癥系統的白細胞。白細胞包括所有的有核血細胞，是免疫細胞的基本構成。通過滅活或者破壞異源物質而發揮保護機體的功能。某些白細胞也具有識別和破壞自身變異細胞的能力。,作用特點,絕大多數細胞因子是低分子量（1530kDa）的蛋白或糖蛋白。高效能作用：細胞因子可以自分泌、旁分泌、或內分泌的方式發揮作用。一種細胞可產生多種細胞因子，不同類型的細胞也可產生一種或幾種相同的細胞因子。多重調節作用（多效性/重疊性）：主要與調節機體的免疫應答、造血功能和炎癥反應有關，還具有其他調節功能。與激素、神經肽、神經遞質共同組成細胞間信號分子系統。,2.2.2 抗體藥物,抗體是機體在抗原性物質的刺激下所產生的一種免疫球蛋白，能與細菌、病毒或毒素等異源性物質結合而發揮預防、治療疾病作用。第一代抗體藥物 動物多價抗血清第二代抗體藥物 利用雜交瘤技術制備的單克隆 抗體及其衍生物第三代抗體藥物 基因工程抗體,基因工程抗體特點,可降低甚至消除人體對抗體的排斥反應；分子量較小，可部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶核心部位；可制備新型抗體；可采用多種表達形式，大量表達抗體分子，從而降低生產成本。,2.3 多肽抗生素,多肽抗生素是指分子量在10kDa以下，具有某種抗菌活性的多肽類物質。特點：以物理的方式作用于細菌細胞膜，使細胞膜穿孔，細胞質外溢而達到殺菌的目的。膜通道的形成能力對抗菌肽的活性起決定性作用。只對原核生物細胞產生特異性的溶菌活性，對最低等的真核生物及某些植物的原生質體、某些腫瘤細胞等也有一定的殺傷力，而對人體正常的細胞無損傷作用。,3 多肽藥物的合成方法,多肽的合成主要有兩條途徑:化學合成和生物合成。化學合成主要通過氨基酸縮合反應來實現。多肽的化學合成有固相合成和液相合成之分,其主要的區別在于是否使用固相載體。,多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略,逐步合成簡潔迅速,被用于各種生物活性多肽片段的合成;片段組合法為合成含100個以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線,并已成功地合成了多種有生物活性的多肽,其最大的特點是易于純制。在生物合成多肽方面,除了常用的發酵法、 酶解法外,隨著生物工程技術的發展, DNA 重組技術也被應用于合成多肽。,3.1 氨基酸的羧內酸酐法,氨基酸的羧內酸酐是氨基酸的一種衍生物,它的氨基保護基也活化羧基。NCA法屬于陰離子開環聚合機理,其引發劑可選用多種親核試劑或堿類。采用NCA法合成多肽的基本反應包括:在堿性條件下, 氨基酸陰離子進攻NCA形成較為穩定的氨基甲酸根離子,在酸化時該離子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又進攻其它的NCA,如此反復進行下去。NCA法具有合成周期短、操作簡單、成本較低、產物分子量高等優點, 在目前多肽合成中所占比例較大,技術也較為通用。但是, 采用NCA逐步法只能合成短鏈多肽片段。,3.2 液相分段合成法,液相分段合成法是多肽片段在溶液中依據其化學專一性或化學選擇性,自發連接成長肽的合成方法,其優點是能得到長肽,但技術還不完善。常用的連接技術主要有: 天然化學連接、化學區域選擇連接、可去除輔助基連接、光敏感輔助基連接、施陶丁格連接和正交化學連接。,3.3 組合化學法,組合化學法是20世紀80年代在固相多肽合成的基礎上發展起來的。它將氨基酸的構建單元按某種組合方式連接起來,合成出包含大量化合物的化學庫, 并從中篩選出具有某種物理、 化學或藥理活性化合物的一套合成策略和篩選方案。與傳統合成方法不同的是, 傳統合成方法一次只合成一種化合物,而組合化學法可同時合成多種化合物。,3.4 酶解法,用酶解法合成多肽,又稱酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白質,將動植物大分子蛋白質降解成小分子活性多肽。酶解蛋白質所用的酶,大多數是肽酶類。近年來，人們運用酸、堿降解蛋白質獲得多肽收獲甚微,固定投資大,周期長,污染嚴重,風險大,未能實現工業化生產。,酶法多肽具有以下優點: 酶解不降低蛋白質的營養價值,可獲得比原食品蛋白質更多的功能; 可保持多肽營養純天然綠色屬性,不含任何化學物質等。但酶解得到的是一系列多肽, 分離純化難度較大, 因此不適于合成單一的多肽。另外,肽酶的催化具有專一性,因此,尋找合適的肽酶也是該方法的一個難點。,3.5 基因工程法,DNA 重組技術的誕生為合成序列確定的多肽奠定了基礎,即可通過設計合適的DNA 模板來控制多肽的序列。利用DNA 重組技術,可以通過重組 DNA 產生的工程菌來大量高效地合成多種生物活性多肽。基因工程法合成多肽具有表達定向性強、產品安全衛生、原料來源廣泛等優點,可以得到質量高療效好且具有天然活性的多肽類藥物, 但存在高效表達等技術難題,分離困難, 產率低, 成本昂貴, 難以用于大規模生產。,4 多肽藥物研究的主要類型,對于多肽藥物的研究依據不同用途或靶向目標，可分為9大類，主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、多肽導向藥物、細胞因子模擬肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其他藥用小肽、診斷用多肽等。,4.1多肽疫苗,和核酸疫苗一樣，多肽疫苗是目前疫苗研究領域內備受關注的研究方向之一。這里主要介紹合成多肽疫苗、多抗原肽疫苗、脂肽疫苗。,合成多肽疫苗(synthetic peptide vaccine)就是用化學合成抗原表位氨基酸序列法制備而成的具有保護性作用的類似天然抗原決定簇的多肽疫苗。這種疫苗不含核酸，是最為理想的安全新型疫苗，也是目前研制預防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。,多抗原肽疫苗(multiple antigen peptide，MAP)是將病原微生物蛋白表面的多種T細胞或B細胞表位的氨基酸連接于樹枝狀的多聚賴氨酸骨架上而形成的一種具有獨特三維空間結構的大分子疫苗。主要具有抗HIV-1、V3、抗裂體吸蟲、脂多糖結合蛋白能模擬抗原位置等作用，在很大程度上促進了多抗原肽疫苗的發展。,脂肽疫苗( lipopeptide vaccines) 是最近10多年來才開發出的一種多肽疫苗, 它是將具有佐劑活性的脂質分子共價連接于抗原多肽鏈而制備成的。這種疫苗不需其它佐劑就能誘導機體產生廣泛的免疫應答,而且沒有佐劑的副作用, 是一種很有應用前景的疫苗設計方法。例如, 用脂肽 P3C核心作為內源性佐劑, 將蛋白的T 細胞表位和 B 細胞表位與水溶性的脂肽P3C 通過肟鍵連接制成四分枝的聚肟疫苗( polyoxime vaccine) ,在沒有任何外源性佐劑的情況下即具有良好的免疫原性。,4.2 抗腫瘤多肽,腫瘤的發生是多種原因綜合作用的結果，但最終都要涉及到癌基因的表達調控。不同的腫瘤產生時所需要的酶等調控因子不同。現在已發現很多腫瘤相關基因及腫瘤產生調控因子，篩選與這些靶點特異結合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱點。小分子多肽不僅廣泛存在于自然界，也可通過人工方法合成，在腫瘤的臨床治療上有重要的價值。美國科學家發現了一種含6個氨基酸的小肽能在體內顯著抑制包括肺、胃及在大腸腺癌等腺癌的生長，為治療這一死亡率很高的惡性腫瘤開辟了一條新的途徑。,4.3 抗病毒多肽,病毒感染后一般要經過吸附(宿主細胞)、穿入、脫殼、核酸復制、轉錄翻譯、包裝等多個階段。阻止以上任意過程的進行均可防止病毒復制，而最有效的抗病毒藥物是作用在病毒吸附及核酸復制2個階段，因此篩選抗病毒藥物主要考察藥物的抗病毒吸附和復制能力。病毒通過與宿主細胞上的特異受體結合吸附細胞，依賴其自身的特異蛋白酶進行蛋白加工及核酸復制。因此可從肽庫內篩選與宿主細胞受體結合的多肽或能與病毒蛋白酶等活性位點結合的多肽，用于抗病毒的治療。,4.4 多肽導向藥物,傳統的抗癌藥物在腫瘤治療過程中通過血液循環，化學藥物在體內擴散后分布于身體各個臟器，并且藥物的選擇性差，在殺死病變細胞同時也攻擊正常細胞，產生很大的毒副作用。很多毒素(如綠膿桿菌外毒素)、細胞因子(如白細胞介素系列)等均有較強的腫瘤細胞毒性，如果長期或大量使用時，它亦可以損傷正常細胞，給機體帶來了很大的副作用，影響對腫瘤的治療效果。針對上述缺點，科學家開展了靶向藥物的研究。利用特異性作用于腫瘤組織或器官的結合分子能解決這個問題，從而改善抗癌藥物的傳遞系統，提高藥物導向的特異性，實現治療的針對性和安全性。,4.5 細胞因子模擬肽,細胞因子是由免疫系統細胞以及其他類型細胞主動分泌的一類小分子量的可溶性蛋白質，包括淋巴因子、干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、趨勢化因子和集落刺激因子等。它是免疫系統細胞間以及免疫系統細胞與其他類型細胞間聯絡的核心，能改變分泌細胞自身或其他細胞的行為或性質，通過與細胞特異的膜受體而起作用。利用已知細胞因子的受體從肽庫內篩選細胞因子模擬肽，成為近年來國內外研究的熱點。現已經篩選出的肽類小分子模擬物主要包括競爭性結合受體和非競爭性結合受體2種類型的模擬肽。國外已篩選到人促紅細胞生成素、人促血小板生成素、人生長激素等多種生長因子的模擬肽。,4.6 抗菌性活性肽,昆蟲在受到微生物或其他外源物質的浸染時，血淋巴會產生相當數量的抗菌蛋白或抗菌肽，這些肽類物質主要是由脂肪體合成后分泌到血淋巴中，是一種十分有效的防御機制，可用來迅速殺死或清除外源的微生物。很多抗菌肽不僅有很強的抗菌、殺菌能力, 而且還能殺死腫瘤細胞。,4.7 用于心血管疾病的多肽,很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用，不僅可用作藥物，亦可用作保健食品。但由于其作用成分不能確定，其應用受到很大限制。據文獻報道多肽在心血管牛理和病理活動的調常和信號傳導中發揮著不可替代的作用，是一種診斷、預防和治療心血管疾病的有效方法。現已發現很多有效成分是小分子多肽，比如我國科學家從大豆內加工分離出的活性多肽，可通過小腸直接吸收，能防治血栓、高血壓和高血脂，還能延緩變老，提高肌體免疫力。從人參、茶葉、銀杏葉等植物內也分離出很多用于心血管疾病的小肽。,4.8 其他藥用小肽,許多生理必需的調節因子都是很小的肽類，生物技術的發展也促進了大量小分子肽藥物的出現，使得小分子肽藥物變得越來越重要。除上述幾大方面已取得較大進展外，在其他很多領域也取得一些進展。如某種合成肽能促進傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合。另外2種合成肽能抑制破骨細胞對骨質的重吸收。,4.9 診斷用多肽,多肽最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，且易于制備，因此裝配的檢測試劑，其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低，易于臨床應用。現在用多肽抗原裝配的抗體檢測包括：甲、乙、丙、庚肝病毒、艾滋病病毒、單純皰疹病毒、風疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風濕等。使用的多肽抗原大部分是從相應致病體的天然蛋白內分析篩選獲得，有些是從肽庫內篩選的全新小肽。,5 多肽藥物給藥途徑的研究,多肽類藥物相對于一般的西藥來說穩定性較差, 其穩定性易受溫度、 pH值等的影響,在體內易降解,半衰期短。這些特殊性使得該類藥物的主要臨床應用劑型為注射劑,但是注射劑, 尤其是對于胰島素等需頻繁給藥的藥物來說, 不僅患者的依從性差,并且副作用也大。因此,相對于注射制劑,蛋白質多肽類藥物的口服、 經呼吸道以及經皮膚或黏膜給藥制劑更具優越性。,5.1 口服給藥途徑,胃腸道對多肽類藥物的低吸收及其中的酶對藥物的降解是口服給藥面臨的兩個最大障礙。因此,尋找合適的吸收位點,避免胃腸道的酶降解作用以及肝臟的首過效應是解決問題的關鍵。除對藥物的結構進行化學修飾,加入吸收促進劑、酶抑制劑等方法外,脂質體、微囊、 微球、納米粒、乳劑等微粒給藥系統也可有效地促進藥物經胃腸道吸收入血液循環,提高多肽類藥物口服的生物利用度。,5.2 呼吸道給藥途徑,制備蛋白質多肽