乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸細菌是一類能利用發酵糖產生大量乳酸的細菌通稱。為兼性厭氧菌，桿狀或球狀，革蘭氏陽性菌，無芽孢，不運動。營養要求高，需要提供豐富的肽類 氨基酸 維生素。在瓊脂表面或內層形成較小的白色或淡黃色的菌落。通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養基。當乳桿菌僅是復雜區系中的部分菌類時，SL培養基常用作為選擇性培養基。對于芽孢乳桿菌常用GYP培養基，鏈球菌有TYC培養基、MS培養基。M17培養基被用作乳球菌的分離培養基。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬的一個種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運動，無鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或橢圓形。乳酸片球菌細胞呈球狀，直徑0.61.0m，在直角兩個平面交替形成四聯狀，一般細胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列。革蘭氏陽性，不運動，兼性厭氧。在MRS培養基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀。乳酸菌在一般瓊脂培養基上形成微小菌落，不易觀察，所以分離時先富集培養并選擇合適的培養基。分離培養基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫-80等物質，也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細菌生長，對乳酸菌無害。培養基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養基中的碳酸鈣形成透明圈，作為分離鑒別的依據，通過對生成的乳酸量進行性能鑒定。乳酸菌生長繁殖時需要多種氨基酸，維生素及微氧，一般菌落比較小。分離培養基一般可添加西紅柿 酵母膏 油酸 吐溫等物質，均具有促進生長作用。也常常添加醋酸鹽抑制有些細菌的生長，對乳酸菌無害。一.篩選方法：1.溶鈣圈法：利用一些產酸類細菌在含CaCO3的培養基上產生CaCO3溶解圈，從而篩選出這些產酸類細菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養基中加入CaCO3的作用是：鑒別能產生酸的細菌；中和產生的酸，以維持培養基的PH。篩選過程：樣品預處理梯度稀釋至10-6選擇合適的稀釋度涂布37培養48h挑選產生溶鈣圈的菌落反復在MRS培養基上劃線挑起單菌落染色，經鏡檢確認為純種挑選革蘭氏陽性單菌落試管穿刺4冰箱保存。2.溴甲酚綠指示劑法：培養基：MRS培養基（含溴甲酚綠酒精溶液）篩選過程：同上，不同之處是稀釋涂布后長出菌落，挑取使溴甲酚綠變色的菌落。二.菌種的分離篩選1.培養基：1.1麥芽汁碳酸鈣培養基：麥芽汁（10BX）1L 預先滅菌碳酸鈣5-10g/L PH自然 （分離用）1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐溫0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚綠 0.01% PH6.0-6.5（分離用）1.3番茄汁碳酸鈣培養基：酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐溫 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分離用）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.51.5蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/LMgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.51.6蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米漿0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5 （發酵或種子培養基）1.7 MRS培養基 （分離培養計數用）蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0g、 檸檬酸氫二銨 2.0g、葡萄糖 20.0g、 吐溫 80 1.0mL、 乙酸鈉 5.0g、 磷酸氫二鉀 2.0g、硫酸鎂 0.58g、硫酸錳 0.25g、瓊脂 18.0g、 蒸餾水1L, pH 6.5。（分離培養基），當MRS培養基冷卻至4550時,加入已滅菌的碳酸鈣, 充分混勻,倒平板。1.8 BCP培養基（溴甲酚紫培養基）乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5溴甲酚紫10ml 自來水1000ml pH6.5-7.0 （分離用）1.9 BCG牛乳營養瓊脂：脫脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6溴甲酚綠酒精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取瓊脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g 溶解后調pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁熱在無菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37培養24h，檢查是否有雜菌。2.分離篩選：2.1富集培養：取1.0g（1.0ml）于無菌細口瓶中，加入無菌麥芽汁液體培養液于瓶口處，密閉，25-32培養48h。若培養基表內出現絹絲波紋物，鏡檢桿狀，革蘭氏陽性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉接2-3次，接種量3-5.2.2菌種分離純化：溶鈣圈法：富集菌液或樣品適當稀釋至10-7，混菌法分離，先加入10-12ml MRS培養基或麥芽汁培養基，凝固后再注入4-5ml水瓊脂培養基，制成厭氧環境，30或37培養2-3天（溫度低時間稍長），可出現針頭狀或圓形稍扁菌落，周圍形成透明圈。挑取透明圈大，培養基變黃的菌落， 反復劃線純化2-3次，所得單菌落編號，經鏡檢后，疑似乳酸菌落接種于MRS培養基培養后保存備用。或接入液體培養基中，25-32培養24-48h，然后穿刺于MRS培養基或麥芽汁碳酸鈣半固體培養基中，25-32培養48h保存備用。2.3性能測定：乳酸菌定性試驗：不同條件下的產酸速率試驗：將分離菌種接種于MRS液體培養基中25 37溫度下培養測不同菌株不同溫度的pH。方法1.吸取發酵液10ml，注入空試管中，加入10硫酸1.0ml，在加入2.0高錳酸鉀約1.0ml，此時乳酸轉化成乙醛。取濾紙一條，在含氨的硝酸銀溶液中浸濕，橫搭在試管口上，將試管徐徐加熱至沸騰，使乙醛揮發，若管口濾紙變黑，證明有乳酸生成。方法2.紙層析法：展開劑為正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛細血管吸取發酵液，多次點樣于新華濾紙上，1.5標準乳酸為對照，平衡2小時后進行層析，3溴甲酚藍顯色計算Rf值。產酸量測定：5.0ml發酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸餾水10-20ml，酚酞指示劑2滴，用0.1mol/l氫氧化鈉滴定至微紅色。醋酸量（g/100mL）= 氫氧化鈉摩爾濃度.Vx90.08x10-3 /樣品毫升數 x100同時，進行單因素試驗，分別考察醋酸速度，耐高溫，耐酒精度，耐低酸度等主要生產性能，選擇優勢菌株。3.菌株鑒定：3.1菌落形態：3.2菌體形態：（革蘭氏染色觀察）染色鏡檢：桿狀 陽性。3.3乳酸菌運動性檢測：半固體穿刺法3.4生理生化：3.3.1生化試驗：產過氧化氫，產硫化氫，葡萄糖產生，硝酸鹽還原，產生吲哚，甲基紅，明膠液化，需氧，精氨酸，糖發酵試驗。3.3.2生理試驗：乳酸菌產酸能力曲線：將篩選的乳酸菌接種于MRS液體培養基中，25-32培養48h，間隔4-6h測定發酵液pH。食鹽對乳酸菌的影響：在MRS液體培養基中，添加0.0 2.0 4.0 6.0氯化鈉，菌種分別接種于培養基中，32培養48h，測定OD值。溴甲酚綠指示劑法：原理：溴甲酚綠指示劑在酸性環境中呈黃色，堿性環境呈藍色，分離培養基配制后PH為6.8，加入溴甲酚綠指示劑呈藍綠色，產酸后菌落周圍變成黃色，較容易鑒別。培養基：BCG牛乳營養瓊脂初篩：將樣品富集液梯度稀釋，適溫培養，平板上出現扁平的黃色菌落及周圍培養基也為黃色初定為乳酸菌。復篩：將典型菌落轉接脫脂乳發酵管，若凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色陽性，連續傳代若干次培養，挑選出3-4h能凝固的乳管保存備用。注：1.乳酸菌篩選常在幾種培養基同時進行： 分別在麥芽汁碳酸鈣培養基，番茄汁碳酸鈣培養基，BCP培養基（溴甲酚紫培養基）同時進行混菌 劃線或涂布培養（放厭氧袋），分別25 37培養48h。菌落觀察：平板表面形成淺色（黃色或白色）小菌落。麥芽汁碳酸鈣培養基表面，菌落周圍形成透明圈，BCP培養基（溴甲酚紫培養基）周圍使紫色的培養基形成黃色包圍圈。觸酶反應：厭氧菌一般無觸酶（過氧化氫酶），用滴管滴加3.0過氧化氫于菌落上，若無氣泡產生，證明該菌為觸酶陰性。將各種特征菌落分別接入斜面，培養后保存，進一步生理生化試驗，以鑒定分別何種乳酸菌。2.菌落鑒定：半固體或雙平板瓊脂利于乳酸菌的生長，菌落出現早。2.1菌落形態觀察：乳白色 邊緣不整齊，稍呈半球狀凸起，實心菌落。 個體形態：半透明 細桿狀 鏈狀排列，大量時呈發絲狀堆積。初步認為乳桿菌。2.2生化鑒定：在吲哚試驗中，加入菌種試管無任何變化，為陰性反應。說明該菌不具有分解色氨酸產生吲哚的能力。明膠液化 淀粉水解 氫氧化鉀試驗均為陰性，說明此菌為乳酸菌。（過氧化氫酶 還原硝酸鹽）糖發酵試驗：發酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖產酸為陽性反應，其余麥芽糖 蔗糖 棉子糖 鼠李糖產酸為陰性反應。根據手冊第九版判斷此種乳酸菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種。（纖維二糖 甘露醇 山梨醇 七葉苷 水楊苷）2.3乳酸菌生長曲線 pH-t測定結果： 三.幾種乳酸菌篩選舉例1.嗜熱鏈球菌：樣品來源：市售酸奶 培養基：M17改良培養基，培養溫度：42，需氧情況：兼性厭氧，篩選方法：常規的稀釋涂布和劃線分離2.保加利亞乳桿菌