第2節(jié)

基因工程的基本操作程序第一課時(shí)【本節(jié)聚焦】1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？第三章

基因工程從社會(huì)中來(lái)1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定蘇云金桿菌Bt蛋白基因棉花細(xì)胞（核心）抗蟲(chóng)棉培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟呢？知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)基因1基因2基因3DNA片段放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段；能編碼特定的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)：非編碼區(qū)：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子注：不能編碼蛋白質(zhì)的序列=

非編碼區(qū)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)注：不能編碼蛋白質(zhì)的序列=非編碼區(qū)+內(nèi)含子一、目的基因的篩選與獲取(1)概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。(2)實(shí)例：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。1.目的基因資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)。科學(xué)家將“殺蟲(chóng)基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲(chóng)蛋白抵抗蟲(chóng)害。目的基因那么，如何篩選目的基因呢？一、目的基因的篩選與獲取2.目的基因的篩選：蘇云金桿菌制成殺蟲(chóng)劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲(chóng)蛋白)如何掌握？抗蟲(chóng)原理？

當(dāng)Bt抗蟲(chóng)蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲(chóng)腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲(chóng)死亡。思考：Bt抗蟲(chóng)蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲(chóng)蛋白只有在某類昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體。Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因怎么獲得？一、目的基因的篩選與獲取利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因從基因文庫(kù)中獲取從生物組織中直接獲取人工合成

前提：方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成（常用）3.獲取目的基因常用的方法

先對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增獲取一個(gè)Bt基因之后，是否就該立即開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)基因操作？

抗蟲(chóng)基因快速獲得大量抗蟲(chóng)基因蘇云金桿菌提取一、目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR是

的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)根據(jù)＿＿＿＿＿的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)

的技術(shù)。（1）PCR的概念：中文全稱原理操作環(huán)境目的PCR擴(kuò)增儀聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。離心管一、目的基因的篩選與獲取2.原理：DNA半保留復(fù)制，即在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取DNA復(fù)制的條件:原則:③能量：親代DNA的兩條鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等由細(xì)胞代謝提供的ATP①模板：②原料：④酶：

堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從子鏈的5'端向3'端延伸方向:特點(diǎn):邊解旋邊復(fù)制、半保留復(fù)制

、多起點(diǎn)雙向復(fù)制體外復(fù)制怎么改進(jìn)體外用高溫代替體外需用耐高溫的DNA聚合酶子鏈合成需要引物

引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈，體內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物體外（PCR）一般以DNA單鏈為引物用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。引物結(jié)合在模板鏈的3’端一、目的基因的篩選與獲取體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無(wú)需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常與兩條模板鏈結(jié)合的2種為小的單鏈DNA）反應(yīng)還需要其它條件，如緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸(3)PCR的進(jìn)行需要的條件4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因dNTP和ATP類似,不但可以提供原料還可以提供能量，無(wú)需添加ATP。一、目的基因的篩選與獲取脫氧腺苷三磷酸（dATP）腺嘌呤脫氧核苷酸

腺嘌呤脫氧核糖PPP~~OHH

在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。——脫氧核苷三磷酸一第一步：目拓展：dNTP2.PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較類型體內(nèi)DNA復(fù)制PCR解旋在解旋酶作用下,細(xì)胞提供能量,部分DNA雙鏈解開(kāi)90℃以上高溫解旋,DNA雙鏈全部解開(kāi),不需要解旋酶酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等耐高溫的DNA聚合酶合成子鏈一條鏈連續(xù)合成;另一條鏈不連續(xù)合成,再由DNA連接酶連接分別從兩條引物的3′端開(kāi)始延伸,都是連續(xù)合成過(guò)程產(chǎn)物完整DNA兩種引物之間的DNA片段相同點(diǎn)(1)都需要提供DNA模板、4種脫氧核苷酸和引物;(2)都是半保留復(fù)制,嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則練習(xí)冊(cè)p90一、目的基因的篩選與獲取(4)PCR反應(yīng)的過(guò)程4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取當(dāng)溫度超過(guò)_____以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段(1)變性：變性90℃3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。(4)PCR反應(yīng)的過(guò)程4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取(4)PCR反應(yīng)的過(guò)程4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因當(dāng)溫度下降

到左右時(shí)，

種引物通過(guò)

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對(duì)引物15’3’引物25’3’(2)復(fù)性：50℃兩由于DNA雙鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模孕枰獌煞N引物思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從0開(kāi)始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。一、目的基因的篩選與獲取(4)PCR反應(yīng)的過(guò)程4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因當(dāng)溫度上升到____左右時(shí)，溶液中的4種_________在耐高溫的_______________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

脫氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：為什么溫度要上升至72℃？思考2：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端一、目的基因的篩選與獲取耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’

變性

復(fù)性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。長(zhǎng)度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高(4)PCR反應(yīng)的過(guò)程一、目的基因的篩選與獲取用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA一、目的基因的篩選與獲取

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段(即出現(xiàn)完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’一、目的基因的篩選與獲取①DNA分子有_____個(gè)②總鏈數(shù)_____條③不含引物的鏈數(shù)：___④含引物的鏈數(shù)_____⑤含引物1或2的鏈數(shù)：______⑥僅含引物1的DNA數(shù)：______⑦僅含引物2的DNA數(shù)：______⑧引物1、2均含有的DNA數(shù)：_____⑨不含引物的DNA數(shù)：______⑩需要引物的總數(shù)：______2n2n+122n+1-2循環(huán)n次：2n-1112n-202n+1-2★(4)PCR反應(yīng)的過(guò)程歸納總結(jié)1.PCR中的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的DNA分子數(shù)21-122-123-12n-1同時(shí)含兩種引物的DNA分子數(shù)21-222-223-22n-2共消耗引物的分子數(shù)22-223-224-22n+1-2練習(xí)冊(cè)p90隨堂檢測(cè)1.下列關(guān)于PCR反應(yīng)體系中所加物質(zhì)作用的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成B.引物使耐高溫的DNA聚合酶能從引物的5′端延伸DNA鏈C.目標(biāo)DNA的雙鏈用作DNA體外復(fù)制的模板D.四種脫氧核苷酸為PCR提供原料B練習(xí)冊(cè)p931.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)能實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)核苷酸序列的大量復(fù)制,相關(guān)敘述正確的是(

)A.該技術(shù)需要用到引物、脫氧核苷酸、解旋酶等B.復(fù)性是為了使解旋后的兩條鏈恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)C.PCR所需的引物是人工合成的短單鏈核酸D.為激活相應(yīng)酶,PCR反應(yīng)緩沖液中需加入Fe2+「即時(shí)應(yīng)用」C解析:PCR技術(shù)不需要解旋酶,高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi);復(fù)性是為了使解旋后的兩條鏈與引物堿基互補(bǔ)配對(duì);PCR需要的大量引物是由人工合成的;Mg2+可激活DNA聚合酶,故PCR反應(yīng)緩沖液中需加入Mg2+。練習(xí)冊(cè)p902.抗蟲(chóng)和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。研究人員采用PCR方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序如圖1所示。回答下列問(wèn)題。(1)步驟①的作用是

;步驟③表示

,溫度應(yīng)控制在

左右。

使雙鏈DNA解旋為單鏈延伸72℃(2)PCR過(guò)程所需的酶是

,其作用的化學(xué)鍵為

,圖1過(guò)程1個(gè)DNA經(jīng)循環(huán)4次需要引物

個(gè)。

耐高溫的DNA聚合酶磷酸二酯鍵30練習(xí)冊(cè)p90即時(shí)應(yīng)用(3)在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),應(yīng)選擇圖2中引物

,原因是

。

Ⅰ和Ⅳ4種脫氧核苷酸需要加到引物的3′端進(jìn)行延伸解析:(3)因?yàn)?種脫氧核苷酸需要加到引物的3′端進(jìn)行延伸,故在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),應(yīng)選擇圖2中引物Ⅰ和Ⅳ。一、目的基因的篩選與獲取5.PCR產(chǎn)物鑒定PCR過(guò)程可以在

中自動(dòng)完成，完成以后，常采用

來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增儀P84PCR儀器PCR→PCR產(chǎn)物→電泳2、DNA移動(dòng)的方向：向與自身帶電情況相反的電極方向移動(dòng)一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便由負(fù)極向正極泳動(dòng)。1、DNA移動(dòng)的原理3、DNA移動(dòng)進(jìn)度的觀測(cè)：依靠：電泳指示劑【拓展】電泳指示劑還可以：使上樣孔中的樣品可見(jiàn)，確保樣品準(zhǔn)確加入孔內(nèi)。電泳原理：指示劑移動(dòng)速率比DNA更快，當(dāng)指示劑遷移至凝膠邊緣時(shí)，提示應(yīng)及時(shí)停止電泳，避免目標(biāo)分子跑出凝膠。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠瓊脂糖的微結(jié)構(gòu)資料卡片：瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，從瓊脂中提取而來(lái)，在電泳緩沖液中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的膠體胨，具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。拓展：瓊脂糖冷卻后形成具有剛性濾孔的膠體胨，凝膠孔徑的大小由瓊脂糖的濃度決定。筆記：瓊脂糖凝膠電泳中影響DNA分子移動(dòng)速率的因素：①凝膠的濃度②DNA分子大小和構(gòu)像③電壓大小（影響凝膠濾孔孔徑大小）規(guī)律：DNA分子越大，遷移越慢。微量離心管：實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴(kuò)增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0作用：抑制核酸酶活性，保護(hù)DNA微量離心管：實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴(kuò)增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0凝膠載樣緩沖液：含：溴酚藍(lán)是：電泳指示劑作用：抑制核酸酶活性，保護(hù)DNA微量離心管：實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴(kuò)增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0凝膠載樣緩沖液：含：溴酚藍(lán)是：電泳指示劑作用：抑制核酸酶活性，保護(hù)DNA核酸染料：的作用：染劑與DNA結(jié)合后能吸收300nm波長(zhǎng)的紫外光，發(fā)出可見(jiàn)熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。與樣品一起添加在加樣孔中配置凝膠糖溶液時(shí)添加在已融化并稍微冷卻后的凝膠中3.基因工程中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。下列關(guān)于PCR及電泳鑒定的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.PCR通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚及模板與引物的結(jié)合B.DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度有關(guān),與DNA分子的大小和構(gòu)象無(wú)關(guān)C.因DNA分子在凝膠載樣緩沖液中帶正電荷或負(fù)電荷,可用于電泳D.采用PCR技術(shù)對(duì)一個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增,若每個(gè)DNA分子的每條鏈都做模板,則第n次循環(huán)共需要引物2n個(gè)「即時(shí)應(yīng)用」B練習(xí)冊(cè)p98課堂小結(jié)實(shí)驗(yàn)1：PCR等濃度、等量參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部移液離心擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)1：PCR使DNA充分變性，雙鏈打開(kāi)，以利于引物更好地和模板結(jié)合思考1：預(yù)變性的目的是什么？思考2：為什么最后1次變性時(shí)間延長(zhǎng)？使DNA充分變性，雙鏈打開(kāi)，以利于引物更好地和模板結(jié)合思考1：預(yù)變性的目的是什么？原理：①TaqDNA聚合酶活性會(huì)隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降，導(dǎo)致在后期的PCR循環(huán)中，會(huì)發(fā)生“部分片段可能沒(méi)有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脫落了”的情況，形成“半成品DNA”。②與正常DNA產(chǎn)物相比，這種“半成品DNA”在變性時(shí)需要的能量更多。目的：為了讓未延伸完全的DNA雙鏈部分完全解開(kāi)，重新延伸。思考3：為什么最后1次延伸時(shí)間延長(zhǎng)？確保DNA鏈完整合成梳子配制瓊脂糖溶液制備凝膠實(shí)驗(yàn)2：瓊脂糖凝膠電泳加樣配制瓊脂糖溶液制備凝膠實(shí)驗(yàn)2：瓊脂糖凝膠電泳加樣【筆記】標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）1、是：已知的DNA分子大小的片段，2、作用：在實(shí)驗(yàn)時(shí)和樣本DNA同時(shí)進(jìn)行凝膠電泳，通過(guò)對(duì)比兩者的遷移速率，可以大致估計(jì)樣本DNA的大小。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣實(shí)驗(yàn)2：瓊脂糖凝膠電泳電泳、觀察分子量大（長(zhǎng)片段）分子量小（短片段）含量少（不亮、細(xì)帶）含量多（很亮、粗帶）歸納總結(jié)利用PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)(1)為避免外源DNA等因素的污染,PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。(2)該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買,緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并放在-20℃的條件下儲(chǔ)存。使用前,將所需試劑從冰箱拿出,放在冰塊上緩慢融化。(3)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí),每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換。(4)在進(jìn)行操作時(shí),一定要戴好一次性手套。2.下列關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定步驟的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.PCR過(guò)程中,需要加入兩種引物B.所有組分加入微量離心管后,需要放入離心機(jī)離心約10sC.將電泳緩沖液加入電泳槽中,電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜D.電泳出現(xiàn)位置不等的幾條條帶,說(shuō)明鑒定的PCR產(chǎn)物比較純凈D練習(xí)冊(cè)p99隨堂檢測(cè)4.用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí),得到以下電泳圖譜,其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker),10號(hào)為電泳緩沖液。進(jìn)行PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不