備案號：鮮番茄及番茄制品中轉基因成分的定性檢測方法infreshtomatoandtomatoprocessedproducts天津市質量技術監督局發布IDMIF-GEN-TIBI、DMIF-GEN-T1B2、DMIF-GEN-T1B3、DMIF-GE本標準由天津市農產品質量監督檢驗測試中心提出。本標準起草單位：天津市農產品質量監督檢驗測試中心、中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人：金紅、趙昕、王永、程奕、鄭貴忠。1鮮番茄及番茄制品中轉基因成分的定性檢測方法本標準規定了鮮番茄和番茄制品中轉基因成分的定性聚合酶鏈式反應(簡稱為PCR)檢測方法。本標準適用于對新鮮番茄果實和以番茄果實加工而成的番茄醬、番茄沙司和番茄汁等制品中轉基因成分的定性PCR檢測。適用于轉基因番茄Nema282F品系的鑒定。2規范性引用文件修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求SN/T1194植物及其產品轉基因成分檢測的抽樣和制樣方法SN/T1204植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法下列術語、定義和縮略語適用于本標準。物種本身不具有的、而是來源于其他物種的功模板基因序列先經高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應條件下，根據模板序列設計的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應的一段互補序列發生退火而相互結合，接著在DNA聚合酶的作用下以四種脫氧核糖核酸(dNTPs)為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環，使欲擴增的基因片段以幾何倍數擴增。對樣品中轉基因成分進行檢測，以判定該樣品是否為轉基因產品。3.4.1GMO:geneticallymodifi3.4.2PCR:polymerasechainreaction,聚合酶鏈式反應。3.4.3DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。3.4.4dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphate,脫氧核甘三磷酸。3.4.5CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花葉病毒35S啟動子。3.4.8PG:polygalacturonase,多聚半乳糖醛酸酶3.4.9Nema282F:美國Zeneca公司的獲準商品化啟動子、NOS終止子和neo基因及人工合成反義PG基因等。24防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的規定執行。5抽樣和制樣按照SN/T1194中規定的方法進行。6.1原理番茄原料所插入的外源基因設計引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術，特異性擴增外源基因的DNA片斷，根據PCR擴增結果，判斷該樣品中是否含有轉基因成分。6.2主要儀器6.2.1電子天平(感量分別為0.01g和0.0001g)。6.2.2恒溫水浴裝置。6.2.3低溫超速離心機，臺式冷凍離心機。6.2.8高溫干燥箱。6.2.9微量移液器(0.1~2.5HL,1~10HL,10~100HL,100~1000HL)。6.2.12凝膠成像分析系統或紫外透射分析儀。6.2.17紫外分光光度計6.3試劑和材料實驗用水為I級。6.3.2三羥甲基氨基甲烷(Tris)。6.3.3二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na·2H?O)。6.3.4聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。6.3.8三氯甲烷：異戊醇=24:1(體積比)。6.3.970%乙醇。g,PVP20g,用濃鹽酸調pH值至8.0。36.3.12氯化鈉溶液(1.2mol/L):1000ml水中溶解70g。6.3.13乙酸鈉溶液(3mol/L):800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調節pH值至5.2,加水定容至1L。6.3.14Tris-HCI溶液(0.1mo/L,pH8.0):800ml水中溶解12.114gTris,冷卻至室溫，用濃鹽酸調pH值至8.0,定容至1L。6.3.15TE緩沖液：Tris0.010mol/L,Na?EDTA1.0mmol/L,用鹽酸調節pH至8.0。6.3.18dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP)溶液6.3.19Taq酶：2U/HL。6.3.20實驗用水：按GB/T6682規定執行。6.3.21溴化乙錠(EB):10m6.3.26Nema282F轉基因番茄陽性樣品。6.3.28濾芯吸頭(10L,20HL,100L,200HL,1000HL)。6.3.29PCR反應管(200H)。6.3.31引物：轉基因番茄的內源基因和外源基因檢測時所用的引物序列見表1。檢測基因擴增片斷長度基因性質內源基因外源基因aatcctgttgccggtcttg-3'’tatcctagttgcgcgcta-3’外源基因gatccttagaagcatctagt-3’人工合成基因品系鑒定外源基因外源基因*:轉基因番茄時擴增出383bp和180bp兩個不同大小的DNA片段，非轉基因番茄只能擴增出383bp6.4.1樣品的DNA提取取番茄醬等液態加工樣品50mL,室溫10000r/min離心15min,棄上清，取沉淀3g轉入預冷的4研缽中，置于冰上研細，全部轉入50mL離心管中。用0.1molLTris-HCI(6.3.14)溶液反復洗滌樣品三次，方法為加入30mL0.1mol/LTris-HCl溶液(6.3.14),反復搖勻，于4℃10000r/min離心15min,棄上清，留沉淀用于DNA提取。取鮮番茄樣品2g,置預冷研缽中，加入液氮(6.3.30)研磨成粉末狀，轉入2mL離心管中，用取經預處理的樣品加入10mL經65℃預熱的CTAB提取緩沖液(6.3.10),混勻。65℃水浴1小時，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次加入等體積的豐氯甲烷+異戊醇(6.3.8)緩慢顛倒搖勻5min,于10000r/min離心10min,取上清，搖勻，室溫靜置1小時，12000r/min離心10min,棄上清，沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液(6.3.12)1mL溶解沉淀，室溫靜置5min,加入等體積三氯甲烷+異戊醇(6.3.8)顛倒搖勻1min,于12000r/min離心10min,取上清，加入10%的3mol/L乙酸鈉(6.3.13)和等體積的冷異丙醇(6.3.7),緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000r/min離心15min,棄上清，加入400HL70%冷乙醇(6.3.9)洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，待沉淀干燥后，加入30HL滅菌的去離子水(6.3.20)溶解從番茄加工制品提取的DNA沉淀，加入100HLTE(6.3.15)溶解從鮮番茄提取的DNA沉淀，均置-20℃保存備用。6.4.2樣品中DNA產量和質量的鑒定采用紫外分光光度法對從鮮番茄中提取的DNA進行產量和質量的鑒定。紫外分光光度法檢測核酸的最佳范圍是2wg/mL~50Hg/mL,OD值應該在0.05~1的區間內。將DNA溶液做適當的稀釋，放入紫外分光光度計的比色皿中，于260nm處測定其鏈DNA。PCR級DNA溶液的OD2采用內源基因擴增法鑒定從番茄加工制品中提取的DNA的質量。通過PCR技術，擴增番茄內源6.4.3定性PCR檢測6.4.3.1PCR反應體系檢測鮮番茄和以番茄果實為原料的番茄加工制品中內源基因和外源基因采用的PCR檢測體系見表2。反應體系中各試劑的量根據反應體系的總體積進行適當調整。每個反應稱10×PCR反應緩dNTP溶液(正向引物(1反向引物(D水對進行PCR檢測時反應體系必須設置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：用Nema282F轉基因番茄材料中提取的DNA作為PCR反應體系的DNA模板；陰性對照：用非轉基因番茄材料中提取6.4.3.3樣品中內源基因和外源基因的檢測5檢測鮮番茄和以番茄果實為原料的番茄加工制品中的內源基因和外源基因的PCR檢測的參考反應條件見表3。反應條件需根據檢測儀器的性能做相應調整。被擴增的擴增最后延伸SSNptI(215b緩沖液制備2%的瓊脂糖凝膠(凝膠融化后晾至60℃合適的DNA分子量標記物，選擇合適的電壓(3V/cm~5V/cm)6.4.3.5凝膠成像分析(照相)電泳結束后，將球脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據DNA分子量標記判斷擴增出的目的條帶的大小，將電泳結果形成電子文件存檔或用照相系統拍照。6.4.4結果分析與判定對于番茄特異性內源基因PG34片段的檢測，如果陰性對照、待測樣品和陽性對照的PCR產物都出現383bp的條帶，則表明提取的待測樣品DNA符合PCR反應的要求，能用于外源基因的檢測；否則不能用于檢測外源基因，應該重新提取待測樣品DNA,直到能擴增出383bp的條帶，防止檢測中產對待測樣品DNA提取液進