抗腫瘤藥品體內篩選標準操作規程

概述：

抗腫痛藥品是指能夠直接殺傷或抑制腫瘤細胞生長或增殖一類藥品，作用機制包含抑制

腫痛細胞核酸或蛋白質合成、干擾大分子物質代謝、|二擾微管系統、抑制拓撲異構酶等。

本操作規程包含和抗腫痛藥品中請臨床試驗和申請上市相關非臨床有效性和安全性研

究內容，其中著力強調非臨床有效性和安全性之間關聯性，和非臨床研究和臨床試驗之間關

聯性。意在首先為抗腫瘤藥品非臨床研究提供技術參考；其次，經過技術要求引導科學有序

研發過程，使中國這類藥品研發更趨規范和合理。

本操作規程僅代表現在對抗腫瘤藥品非臨床研究通常性認以。具體藥品非臨床研究應在

本指導標準基礎上，依據藥品本身特點制訂研究方案。

研究目標：

建立一套包含抗腫瘤藥品體內作用藥效學研究和評價體系及對應標準操作規程和抗腫

瘤藥品安全性和作用新機制研究。

①有效性研究

抗腫瘤藥品有效性研究目標關鍵在于探索受試物作用機制、作用強度、抗瘤譜等，為以

后安全性評價和臨床試驗中適應癥、給藥方案選擇提參考信息.

②安全性評價

安全性評價目標關鍵包含：（1）估算I期臨床試驗起始劑量：（2）估計藥品毒性靶

器官或靶組織：（3）估計藥品毒性性質、程度和可逆性；（4）為臨床試驗方案制訂提供參

考。

研究計劃：

（a）小鼠急性毒性測試

根據急性毒性測試常規方法，選擇昆明種小鼠，經過腹腔注射方法給藥,測定體外抗腫

瘤活性突出化合物半數致死量(LDQ,參考給藥小鼠體重改變情況，評價化合物急性毒性,

并確定小鼠體內抗腫瘤活性測試給藥劑量。

(b)小鼠體內抗腫瘤活性測試

依據動物體內抗腫瘤活性測試標準方法，選擇昆明種小鼠，皮下接種肉

瘤S180或肺癌H22瘤株，選擇體外活性突出且急性毒性較低化合物，設定適宜

劑量經過腹腔注射方法給藥，以臨床常見抗腫瘤藥品環磷酰胺作為陽性對照藥

品，測定腫瘤生長抑制作為體內活性評價指標、

(c)專利保護范圍內化合物繼續合成

申請保護范圍較大專利，合成部分可能含有良好活性新化合物，拓展研究范圍，發覺

活性更強化合物，并申請新發明專利。并可針對具體化合物申請隸屬專利，延長高活性化合

物保護期限。

(d)體外抗腫瘤活性廣泛篩選

采取MTT法或臺盼藍染色法，測定化合物對多個人腫癖細胞株增殖抑制活性，確定

化合物在不一樣瘤株間抗腫瘤活性選擇性，為裸鼠模型試驗提供依據。

(e)抗腫瘤作用機理深入研究

依據抗腫瘤(f)人癌喋鼠移植瘤模型試驗活性化合物作用機理特征，選擇微管蛋白

聚合等試驗從分子水平確定化合物作用機理：利用人臍靜脈血管內皮細胞探討化合物對內皮

細胞骨架影響及誘導凋亡途經，從細胞水平上說明化合物作用機理。

依據抗腫瘤新藥審批措施要求，采取裸小鼠皮下接種模型和/或原位移植瘤模型，以

相對腫瘤增值率和生存時間為指標，確定化合物抗腫瘤活性。

(g)動物體內藥品代謝動力學試驗

選擇在人癌裸鼠移植病模型試驗中活性良好化合物，開展動物體內藥品代謝動力學

試驗，考查化合物吸收、分布、代謝、排泄性質。

(h)動物亞急性，K毒試驗

依據抗腫瘤新藥審批措施要求，測定動物亞急性、長毒性質，進行藥品安全性評價。

基礎方法:

①小白鼠灌丹法

以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先從小白鼠口角插入口腔內，

然后沿著上顆壁輕輕插入食管，稍感有阻力時（大約灌胃管插入1/2,相當于食管過膈肌部

位），即可推進注射器，進行灌胃（圖1）。若注射器推進困難，應重插。若灌胃器誤插入

氣管給藥，可致小白鼠死亡。注藥后輕輕抽出灌胃管。此法1次給藥量為0.01-0.03nWg。

圖1.小白鼠捉持及其灌胃法

②小白鼠皮下注射法

通常在其背部皮下注射。將其皮膚拉起，注射針刺入皮下，把針尖輕輕左右擺動，易擺

動表示已刺入皮下，然后注射藥液。拔針時，以手指捏住針刺部位，以預防藥液外漏（圖2）。

該法對小白鼠1次注射藥量為0.01-0.03ml公

圖2.小臼夙皮下注射法

③小白鼠靜脈注射法

通常采取尾靜脈注射法。事先將小白鼠或大白鼠置于固定筒內或鐵絲罩內，或扣于燒杯

內，使其尾巴露出（圖3）。將尾置于45-50C溫水中浸泡或用75%酒精棉球擦之，以使血

管擴張。然后，選擇尾巴左、右兩側靜脈進行注射。注射時若出現隆起白色皮丘，說明藥品

未注入血管。這時，注射器應向尾根部位移動，重新注射。該法對小白鼠1次注射量為

0.005-0.0Iml/go

圖3小白鼠尾靜脈注射法

④小白鼠腹腔注射法

以左手捉持小白鼠，讓其腹部向上，右手將注射器針頭刺入皮膚，刺入部位距離下腹部

腹白線梢向左或右位置（圖4）。向前推進注射器3-5mm,,接著使注射針和腹部皮膚面呈

45°刺入小白鼠腹肌，繼續向前刺入，針頭經過腹肌進入腹腔后阻力消失，這時即可慢慢注

入藥液。對小白鼠1次注射量為0.01-0.02ml/g。

圖4.小鼠腹腔注射法

⑤試驗動物標識

試驗用較大動物如兔、貓、犬等可用特制號碼牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,

可用黃色苦味酸（3%-5%）涂于毛上標號。其編號方法無統一要求，以下方法可供參考。

如給小鼠標識170號，可將小鼠背部分前肢、腰部、后肢，按左、中、右分為九個區,

從右到左標識1-9號,第10號不標識（圖5a）。如給小鼠標識1-20號，則（圖b）.

1號------右前肢II號------腰部及右前肢

2號------左前肢12號------腰部及左前肢

3號------左后肢13號-----腰部及左后技

4號------右后肢14號-----腰部及右后技

5號------頭部15號-----腰部及頭部

6號------頭部及右前肢16號------腰、頭部及右前肢

7號------頭部及左前肢17號------腰、頭部及左前肢

8號------頭部及左后肢18號------腰、頭部及左后肢

9號------頭部及右后肢19號------腰、頭部及右后肢

10號------腰部（背中間20號------尾根部

圖5.小鼠、大鼠皮毛標識編號法

(a)小鼠急性毒性測試

目標：

測定LDso了解受試物毒性強度、性質和可能靶器官，為深入進行毒性試驗劑量和毒性

觀察指標選擇提供依據，井依據LD、u進行毒性分級。

結果判定：

①如LDso小于人可能攝入量1(X)倍，則放棄該受試物。如LDso大于或等于100倍者，

則可考慮進入卜一階段毒理學試驗。

②如動物未出現死亡劑量大于或等于10g/kgBW(涵蓋人體推薦量100倍)，則可進入

下階段毒理學試驗。

③對人可能攝入量較大和其它部分特殊原料，按最大耐受星法給最大劑量動物未出現死

亡，也可進入下一階段毒理學試驗。

范圍：

本方法要求了急性毒性試驗基礎技術要求。

術語和定義：

下列術語和定義適適用于本方法。

①半數致死量(LD5。)是經口給受試物后，預期能夠引發動物死亡率為50%單?受試物劑

量，該劑量為經過統計得出估量值。其單位是每千克體重所攝入受試物質毫克數、克數或亳

升數，即mg/kgBW、g/kgBVV、mL/kgbWo

②最大耐受劑量法(MTD)：用最大使用濃度和最大濯胃容量給20只動物后，連續觀察7-14

天，未見任何動物死亡，則MTD大于**g/kgBW。

原理

經口一次性給或24h內數次給受試物后，在短時間內觀察動物所產生毒性反應，包含致

死和非致死指標參數，致死劑量通常見半數致死劑量LD5。來表示。

試驗動物

通常均分別用兩種性別成年小鼠或大鼠。小鼠體重為l8-22g,大鼠體重為l80-220g。如

對受試物毒性已經有所了解，還應選擇對其敏感動物進行試驗，如對黃曲霉素選擇

雛鴨。動物購置后適應環境3-5天。

操作步驟

①受試物處理：

受試物應溶解或懸浮于適宜介質中。通常采取水或食用植物油作溶劑，能夠考慮用按甲

基纖維素、明膠、淀粉等配成混懸液：不能配制成混懸液時，可配制成其它形式（如糊

狀物等）。必需時可采取二甲基亞碉。但不能采取含有顯著毒性有機化學溶劑。如采取

有毒性溶劑應單設溶劑對照組觀察。

②受試物給

路徑：經口。

試驗前空腹：動物應隔夜空腹（通常禁食16h左右，不限制飲水）。

容量：各劑量組灌胃容量相同（nWkgBW）,小鼠常見容量為20n】L/kgBW：大鼠常見

容量為10ml/kgBWo

方法：通常一次性給受試物。也可一日內數次給（每次間隔4-6h,24內不超出3次，盡

可能達成最大劑量，合并作為一次劑量計算）。

常見急性毒性試驗設計方法

雷恩氏（Horn）法

預試驗：可依據受試物性質和已知資料，選擇下述方法：通常多采取0.1、1和10g/kg

BW劑量，各以2-3只動物預試。依據24內死亡情況，估量LDso可能范圍，確定正式試驗

劑量。也可簡單地采取一個劑量，如2l5mg/kgBW,用5只動物預試。觀察24h內動物中

毒表現。如癥狀嚴重，估量多數動物可能死亡，即可采取低于215mg/kgBW劑量系列，反

之疥狀較輕,則可采取高于叱劑量劑量系列°加有對應文件資料時可不進行預試.

動物數：通常每組用5只。

常見劑量系列：1.00

2.l5X10*t=0,±l,±2,±3

4.64

因為劑量間距較1.OO/3.16X1O'1=0,±1,±2,±3為小，所以結果較為正確。通常試

驗時，可依據上述劑量系列設計）個組，即較原來方法在最低劑量組以下或最高劑量組以上

各增設一組，這么在查表時輕易得出結果。

正式試驗：

將動物在試驗動物房喂養觀察3-5天，使其適應環境，證實其確系健康動物后，進行隨

機分組。給受試物后通常觀察7或14天，若給后第4天繼續有死亡時，需觀察14天，必需

時延長到28天。統計死亡數，杳表求得LDso,并統計死亡時間及中毒表現等。

該方法優缺點：優點是簡單易行，節省動物；缺點是所得LDso可信限范圍較大，不夠

正確。但經多年來實際應用和驗證，同?受試物和寇氏法所得結果極為相近。所以對其測定

結果應認為是可信和有效。

最大耐受量試驗:

適宜條件：相關資料顯示毒性極小或未顯示毒性受試物，給動物最大使用濃度和最大灌

胃容量受試物時，仍不出現死亡。

動物：最少雌、雄各10只。

劑量：受試物最大使用濃度和灌胃容量（一個劑量組）。

方法：動物購置后觀察3-5天，給最大使用濃度和最大灌胃容量受試物（?日

內1次或數次給，一日內最多不超出3次），連續觀察7-14天，動物不出現死亡，則認為

受試物對某種動物經口急性毒性劑量大于某?數值（g/kgBW）。最大灌胃容量小鼠為20

mL/kgBW,大鼠為20mL/kgBW?

（b）小鼠體內抗腫瘤活性測試

體內試驗用于確定受試物對特定類型腫瘤細胞殺傷或抑制作用，探索受試物產生藥效作

用紿藥劑量、路徑、頻率、周期等。體內試驗通常采取動物腫瘤移植模型和人癌移植模型。

因為動物腫瘤移植模型和臨床療效之間相關性不強，僅可用于候選化合物初步篩選。通常情

況下，以人癌移植模型試驗結果來評價抗腫瘤藥品有效性。

1、模型建立

細胞毒類抗腫施藥品臨床前體內試驗通常最少應選擇6種人癌移植痛模型，其中應

包含II期臨床試驗中擬篩選腫瘤組織類型。模型建立和使用應注意：移植瘤復蘇后通常

應傳2-3代后再用于體內抗腫瘤試驗：為了保持移植瘤生物學特征和遺傳特征，宣蘇后移

植瘤體內傳代應少于15-20代。

2、試驗設計

腫瘤移植部位關鍵在皮總也包含腹腔、腎囊下和原位等。通常待移植腫瘤生長至

100-300mm：‘后將動物隨機分組給藥。通常包含高、中、低3個劑量診療組、陽性對照組和

陰性對照組。診療組受試物劑量選擇應能夠表現出藥品量效關系，高劑量不宜超出受試物

最大耐受劑量。應依據受試物藥動學特點和毒性反應等確定給藥頻率和周期；給藥路徑應

盡可能和推薦臨床用藥路徑相同。陽性對照藥通常應滿足以卜.條件：（1）和受試物作用機

制相同或相近：（2）對移植腫瘤敏感；（3）臨床廣泛應用且療效確切。陽性對照藥給藥方

案應能夠表現出藥品最好診療作用，其劑量通常不宜超出最大耐受劑量。陰性對照組給對應

溶劑。

3、檢測指標

推薦使用測量瘤徑方法，動態觀察受試物抗腫瘤效應。腫瘤直徑測量次數依據移植相生

長情況而定，通常為每七天2-3次。在試驗中還應該觀察和藥品安全性相關指標，如動物

體重增加和死亡率，將診療組這些數據和標準診療對照組進行比較，對于判定藥品安全性和

開發前景含相關鍵意義。試驗中應統計檢測指標改變和給藥時間關系，方便了解藥品作用

特點，降低單次統計試驗結果可能引發誤差。體內抗腫瘤試驗結果中還應同時附有對應照片。

4、評價標準

對于體內試驗結果評價應綜合考慮受試物作用機制、模型臨床相關性、每一個模型具

體試驗結果和受試物和陽性對照藥品試驗結果比較。

針對每一個人癌移植病模型，推薦采取相對腫瘤增殖率T/C(國)作為試驗評價指標，

評價標準通常為：T/C(%)>40%為無效：T/C(%)W40舟，并經統計學處理P<0.05為

有效。在體內有效性試驗采取全部人癌移植模型中，通常最少應有1/3達成有效標準，才

提醒藥品有必需進入臨床試驗。

在評價時還應關注受試物和陽性對照藥試驗結果比較。在毒性相當(在有效性研究中關

鍵表現為動物體重下降相當)情況下，對受試物診療組和陽性對照藥組腫瘤增殖率比較也是

評價受試物是否有必需進入臨床試驗指標之一。

附：

①相對腫瘤增殖率T/C&)：針對每一個人癌移植瘤模型抗腫痛活性評價指標。計算

公式以下：T/C%=Trn/C?r*100%o(TKTV：診療組RTV；c?r：陰性對照組RTV).

②腫瘤體積(lumorvolume,TV)計算公式為：V=l/2XaXb'或n/6XaXbXc。其中a、

b、c分別表示長寬高。因為此兩公式相關性極好，可采取任一公式。依據測量結果計算出

相對腫痛體積(relativetumorvolume,RTV),計芽公式為：RTV=Vt/V(l0共中Vo

為分籠給藥時(即d?)測量所得腫瘤體積，V,為每一次測量時腫痛體積。

鼠S180移植瘤抑制作用試驗

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試驗用藥品

1.1.2動物及瘤株

肉瘤Si80；試驗用昆明小鼠18-22go

1.1.3儀器設備

灌胃器、手術器械、天平、離心機

1.2方法

1.2.1腫瘤模型建立

小鼠SM細胞接種于昆明種小鼠腹腔后，取腹水傳代供留。取腹水傳代第7日荷

瘤小鼠，脫頸椎處死小鼠，消毒腹部皮膚，無菌注射器吸收乳白色腹水，用生理鹽水

調整腫瘤細胞濃度為1X10?/mL,用酒精棉球消毒昆明種小鼠右側腋卜.皮膚，于皮卜?

接種上述瘤細胞懸液（0.2mL/只），常規喂養。

1.2.2藥品對小鼠S間抑制作用

昆明種小鼠50只，腋下接瘤，次F1將荷瘤小鼠隨機分為5組，每組10只。分別

為模型組、環磷酰胺（CTX）組、藥品高、中、低劑量組。干后，稱取瘤重，，計算抑

瘤率：小鼠接瘤后第二日開始按表1所表示劑量和方法給藥，CTX組于接瘤后第2日

給藥，隔天一次，藥品組每日給藥一次，連續10天，給藥體積為0.2ml/2（）g體重。

末次給藥二十四小時后，脫頸椎處死小鼠，剝取瘤組織，去除血污、脂肪等非腫瘤組

織，用濾紙吸

抑瘤率臟（1一給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重）X100%

表1荷瘤小鼠給藥劑量和方法

組別劑量(mg/kgB.W.)給藥方法

模型——

CTX20腹腔注射

高一灌VI

中—灌胃

藥品

低一港得

1.2.3對荷瘤小鼠免疫器官影響

動物接種S,瘤株為第0天，第1天開始灌胃，連續灌胃10天，第11天處死

動物，正確稱量動物體重、狗腺重量、脾臟重量，計算胸腺指數和脾臟指數，臟器指

數=贓器重量/體重。

表2藥品對免疫指數影響仁土S)

劑量動物數胸腺指數脾指數

組別

(mg/kgB.W.)(n)(1X103)(1X10

空白對照一10

CTX20i.p.10

—10

藥品—10

—10

1.2.4腫瘤組織學觀察

取部分瘤組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，經蘇木精一伊紅染色,

光鏡觀察。

試驗步驟

①固定液、染色液配置

固定液：

(1)10%中性福爾馬林(pH7.0)

甲醛100ml

NaH2PO4H2O4g

Na2HPO413g

蒸僧水900ml

(2)Harris蘇木素：

配方：

蘇木素1g無水乙醇10nil

蒸謂水200ml鉀明磯20g

HgO0.5g

先將蘇木素溶于無水乙醇中，備用。把明機放入蒸儲水，加熱溶解，再加入備用蘇木素，

我沸2分鐘，先加入少許氧化汞，預防氧化過程中蘇木素外溢，玻棒攪拌，然后，邊攪拌

邊加入氧化汞。加完后，立即移至冰水中，加速其冷卻，靜置一夜后，過濾。用前以5%百

分比加入冰醋酸。

(3)伊紅(醉溶性)

配方：

伊紅(醉溶性)2.5-5g

75%酒精1000mi

加幾滴冰醋酸至半透明狀。

伊紅有水溶和醉溶，假如用是水溶，應該在脫水前進行染色，假如是再溶，應使用和溶解伊

紅等濃度酒精開始脫水。

(4)鹽酸酒精分化液：

濃鹽酸0.5?1ml

75%酒精99ml

(5)蛋白甘油:

蛋白甘油是粘貼蠟片用粘片劑。配方以下：取一新鮮雞送送白.充足攪拌成雪花狀泡

沫，然后濾去泡沫，加入等量甘油，攪拌均勻，再加入一小粒麝香草酚防腐。

②試驗用具：解剖器一套、單面刀片、切片刀、切片機、載玻片、蓋玻片、標本瓶、燒杯、

量筒、漏斗、染色缸、樹膠瓶、酒精燈、毛筆、繪圖紙、濾紙、熔蠟箱(或恒溫箱)、展片

臺(或燙板)、小木塊、蠟帶盒、烤片盒、切片托盤。

③病理標本采集和制作

⑴取材

脫頸椎處死小鼠，剝取瘤組織，去除血污、脂肪等非腫痛組織。

(2)固定和修塊

快速將胰腺放入4%中性甲醛(用PH7.0-7.2磷酸緩沖液配制)中固定48小時，組織塊

直徑應小于7mm。

(3)脫水和透明

在以下過程，要求常?；蝿咏M織塊，以確保組織塊能夠充足地和乙醉或二甲荒接觸，在

每一步驟以后，要充足灌干組縱塊，通常見筒紙吸干組織塊上液體，以免影響其它液體濃度,

但要預防組織塊干燥。全過程約需要4.5h(270min)o

1.75%乙醇50min

2.85%乙醇50min

3.95%乙醇(I)30min

4.95%乙睥(II)30min

5.100%乙醇(I)30min

6.100%乙醇(II)30min

7i/2二甲苯(乙醇和二甲苯等體枳)20min

8.二甲苯(I)20min

9.二甲苯(II)lOmin(可依據透明效果而定)

透明效果判定：如組織塊顏色加深透明，二甲苯溶液顏色透明，即表明脫水效果很好：

如脫水不好，二甲苯溶液顏色會變混濁。使用過酒精或二甲苯倒入燒杯里方便回收。

(4)浸蠟、包埋和修蠟塊

1.浸蠟：可在脫水和透明進行時，將60C恒溫箱打開，使大燒杯內石蠟充足溶解，

待脫水和透明結束后，可將脫水籃整個或包裹在紗布內組織塊轉入充足溶解石蠟里，于60℃

恒溫箱放置120分鐘。

2.包埋：包埋有多個器具，比較簡練廉價方法是采取紙盒?？稍诮炌瑫r將紙盒做

好，包埋時將60℃石蠟倒入紙盒內，然后用小鑲子將各組織塊按一定次序排列好，使切面

朝下。我們提議，不一樣組別同一組織包埋于一個蠟塊中，以確保切片和染色條件一致，且

方便讀片和比較。為預防倒入紙盒內石蠟底部立即凝固，可將紙盒置于一玻璃板上(或大培

養皿內)，然后將玻璃板置于80-90C左右熱水上，包埋時蠟盒底部要放平，做蠟塊蠟要反

復凍融很好,。組織包埋方法可參見表2。

3.修蠟塊：待紙盒內蛤凝固后(若需要使蠟塊快速凝固，可將包埋好蠟塊置于4℃冰

水混和物中)。將蠟塊取出，月刀片將其修成梯形，通常蠟塊大小視組織多少而定，為確保

切片順利，組織塊和蠟塊邊緣之間距離不得小于2mm。修剪下來殘蠟應回收，方便再用。

(5)切片

在載玻片上.擦少許甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于載玻片上，用手指充足抹勻，呈半干

狀為佳。

切片厚約務?迎m,通常厚約6pm,細胞小而密組織如胸腺，能夠切心5用口，而細胞疏

組織，以卜丘腦可切lOjim。將切片在55c左右水浴中展開，展開程愎以帶黃顏色組織完全

攤平為準。

用涂有甘油蛋白載玻片從水浴中撈取切片，斜放在木架上，立即放入37C烘箱中過夜，

通常時間越長久有效果越好，以切片緊貼于載玻片上呈半透明狀為佳。每個組織塊撈片2

張。

過夜后，將載玻片置于玻片架匕進行下面試驗。

(6)脫蠟、染色和脫水

取出玻片架后，應將玻片架傾斜，以使我玻片上試劑流出，然后用筒紙將玻片架和載

玻片下緣試劑吸干，以免影響其它試劑濃度。全過程約需要50min。

1.脫蠟到水

(1)二甲苯(1)15分鐘

(2)二甲苯(II)15分鐘

(3)100%乙醉2分鐘

(4)95%乙醇(I)1分鐘

(5)95%乙醇(II)I分鐘

(6)蒸儲水浸洗1分鐘

2.染色

(7)蘇木精30秒鐘

(8)自來水沖洗I分鐘，但應注意不能用水直接沖在玻片上，以免沖走切片。(顯微

鏡下觀察效果)

(9)伊紅(著色即可)10秒鐘

(10)蒸儲水浸洗1分鐘

3.脫水

(10)95%乙醇(I)1分鐘

(11)95%乙醇(II)1分鐘

(12)100%乙醉2分鐘

(13)二甲苯(I)2分鐘

(14)二甲苯(II)3~5分鐘

(7)封片

將載玻片從玻片架上取下，滴加1~2滴中性樹膠，用眼科鑲夾住蓋玻片一角，輕輕蓋

上蓋玻片，讓中性樹膠沿著蓋波片充足展開，以后傾斜載玻片，用筒紙將多出中性樹膠吸干,

同時注意避免有氣泡產生，平放我玻片，室溫下長久保留。

1.2.5數據處理

全部試驗設3個平行組或反復3次，結果以［土s表示，用SPSS13.0統計分析

軟件對各組數據及數據間差異顯著性水平進行統計學分析C

注意事項

①相關腹水傳代，觀察到第一代種鼠肚子較大后（通常約8-9天左右），能夠傳代，傳代時

取1ml注射器，用2nli注射器針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取腹水即可，注意

不要把針頭插得很深，盡可能淺一點，還能夠把老鼠拎起來，利用重力，讓腹水集中在某處

便于抽取，通常抽個0.5ml就能夠了，不用離心，直接用PBS3-6倍稀釋后，接種到新老

鼠腹腔，腹水顏色為白色或略有發黃全部是正常，不過血性腹水說明不好，需要注意調整，

第二代以后，盡可能6-7天時候傳代，不要等時間太久，不然腹水輕易血性。三代后可用于

試驗。

②相關接種進行試驗，這個時候抽取腹水需要量比較多，通常需要處死種鼠后，小心地用消

毒眼科剪刀鐐子剝開腹部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用粉子拎起腹部肌肉，用剪刀剪

開一個小口，然后用玻璃滴管或去掉針頭注射器吸收腹水。稀釋后，接種到小鼠腋下。相

關稀釋量，最好探索一下，開始時候能夠合適計數，污染。不過要用臺盼蘭染色后計活細胞

數。接種部位在小鼠腋下，不過不要深入到腋窩里面，會給以后操作帶來麻煩。接種時進

針處離接種處遠一點，讓針頭在皮下多走一段，不輕易

③細胞接種量控制在IX10、只時，小鼠腹水出現情況通常以下：5?6d出現腹水，7?9d

抽取傳代最好，10?12d出現血性腹水，14?15d小鼠開始死亡。

④假如動物固定不佳，注射腫瘤細胞時針頭在皮下往返游動，結果是腫瘤長成后不能成為

一個球形或半球形，而是成為有多個小痛體組成長條或不規則形狀。

⑤相關觀察指標，關鍵是按時稱體重，試驗結束后剝取腫瘤稱痛重。因為出瘤已經是接種后

第6天左右了，第10天就結束時間，瘤體積數據意義就不大。根據SFDA要求，平均瘤重小

于1g，或單個瘤重小于200irg,認為腫瘤牛.長不良，試驗作廢。

（d）體外試驗法：用培養腫瘤細胞系進行。

體外試驗關鍵用于對候選化合物進行篩選，初步了解受試物作用機制、敏感腫痛類型

和作用強度，為隨即進行體內試驗提供參考。

在體外培養不一樣人腫瘤細胞系中加入不一樣濃度待測藥品，采取橫酰羅丹明染色法

（SRB法）、四氮哩鹽還原法、集落形成法等方法進行檢測，計算藥品半數抑制濃度（IC5。），

并和標準診療藥品進行比較，能夠初步估計抗腫瘤藥品抗瘤譜和作用強度。應依據化合物結

構特點和作用機理確定體外試驗采取研究方法。比如，以線粒體為作用靶點藥品不宜采取

四氮嗖鹽還原法。

試驗中，在選擇腫瘤細胞系時應考慮到細胞生長和增殖速率，通常最少應選擇12種人

癌細胞系。藥品和細胞共培養時間通常為48?72小時，貼壁細胞需先貼壁24小時后再給

藥。試驗應設陽性及陰性對照組，陽性對照為標準抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照。試驗最

少應反復一次。

1、噫喋藍（MTT）法在培養活細胞線粒體中和NADP相關脫氫前可將黃色四氮噗

（MTT）催化成不溶性藍紫色甲替，將甲替用二甲基亞颯（DMSO）溶解后，利用酶標儀（試

驗波長570nm,參比波長450im）測定光密度值，根據公式

試驗組光密度值

腫瘤細胞生長抑制率（%）=（1-）X100%

對照組光密度值

計算藥品對腫瘤細胞生長抑制率。用系列濃度藥品可制作腫瘤細胞生長抑制率星效曲

線。

2、染料排斥法本方法是依據活細胞含有排斥一些染料功效，而死細胞因胞膜破壞而

易于被染料著色原理，在培養對數生長久細胞懸液中加入伊紅、臺盼藍、或苯胺黑等染料，

在室溫下放置5分鐘后，在15分鐘用血球計數板計數200個細胞。依據公式

未染細胞數

活細胞率（％）=X100%

細胞總數

3、生.長曲線法本方法是依據腫瘤Gompcrtzian生長曲線而設計。培養腫痛細胞在早

期為指數增殖期，伴隨細胞密度增加，因代謝產物積聚和營養物質消耗，增殖趨于減緩乃至

停止，進入所謂平臺期。在培養后立即、I、2、3、4、5、7天細胞，用臺盼藍染色，細胞

計數，然后取細胞對數對培養時間作圖可獲細胞生長曲線。1）將生長曲線外延至Y軸可取

得截距No,,用公式

對增殖細胞的殺傷力=必弛、100%

No

計?算藥品對增殖細胞殺傷力（N。、是對照組截距）

2）用Nt代表接種后I小忖細胞數，用公式

TD=0.3011/logNt-LogNo

計算藥品對細胞增增時間（TD）影響。

3）取平臺期每毫升細胞均數，比較細胞生長飽合密度（Ns）。

4、集落形成法本方法利用分裂之6代以上克隆原單細胞子細胞可形成集落成簇（每

簇細胞數＞50）能力，比較藥品對單個腫痛細胞增殖能力影響。本方法有貼壁法和半固體培

養法兩種。

1）貼壁法需要選擇貼壁生長細胞，按500細胞/ml濃度接種到35mm培養皿中，培

養后棄去培養基，用瑞氏-姬姆薩染色后，在20X解剖顯微鏡下計數含有50i個細胞細胞集

落。

2）半固體軟瓊脂培養法取對數生長細胞，用含小牛血清培養液稀釋成1000細胞/ml

懸液；溶化3%瓊脂液，并按1：9百分比和含小牛血清新鮮培界液混合，倒入33mm培喬

1111（lml/1111）,室溫下待瓊脂凝固，取0.94ml細胞懸液，力U0.3ml5%瓊脂，加到已制備瓊脂

平皿中，室溫下凝固。移入培養箱培養。在I6X解剖顯微鏡下計數直徑大于75"m細胞集

落。以集落形成抑制百分率對對數劑量作圖，可得“S”型曲線，從曲線上求取半數抑制濃

度IC50；以集落存活分數和劑量作圖，可取得克隆原細胞存活曲線，方程為S=l-(l-e-D/Do)n,

S為存活分數，D為劑量，D。為存活分數每下降1/e時所需藥品劑量，n為外推值。

D。越小，藥品殺傷力越大，N越大殺死細胞藥品劑量越大。

5、硫化若丹明B法(SRB)法硫化若丹明(suiforhamincB)呈粉紅色，溶于水，可

和生物大分子堿性氨基酸結合，這種結合物在波長515nm時讀數和細胞表現出良好線性關

系，可用于細胞定量。測試細胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB，室溫下靜置，然

后去除未結合SRB,用非緩沖iris堿液溶解結合SRB,在自動化分光光度平板讀數儀(515nm

波長)測定OD值?？梢罁率龉接嬎悖?/p>

T-To

生長率(％)=XKX)%

C-To

C、T和T。分別為對照組細胞，為給藥組細胞，另外對照平板加藥時細胞QD值。

T-To

殺傷率(％)=X100%

T

T-To

50%生長抑制所需藥品濃度(GI50)=X100%

C-To

T-To

殺死50%細胞所需藥品濃度(LCso)=X100%

To

(e)抗腫瘤作用機理深入研究

（一）藥品作用周期特異性研究

進行藥品作用細胞周期性試驗必需首先制備同時化細胞，常見體外培養細胞同時化方法

有機械振蕩法、雙胸時同時法、含羞草氨酸俘獲法和離心洗脫法。

1、機械振蕩法機械振蕩法分離同時化細胞是基于單層貼壁牛.長細胞在進入有絲分裂

期時，胞形變圓，松散地附在支持物上，利用搖擺或拍擊培養瓶能夠剝離出這些細胞，利用

此方法能夠得到較純M期細胞。雙胸背同時法原理是先以高濃度TdR處理細胞，使細胞內

dTTP升高，后者抑制CDP向dCDP轉變，DNA復制受阻，S期細胞停滯在S期，其它期

細胞積聚在G/S邊界；撤TdR,讓原處于S期細胞完全越過S期，再給TdR,讓越過S期

細胞進入GKS邊界，然后撤云TdR,讓細胞重新生長，同時進入S期。所以，本方法能夠

得到較純S期細胞。

2、含羞草氨酸俘獲法含羞草氨酸可將細胞集結于Gi/S邊界，阻止細胞進入S期。

在撤消含羞草氨酸后，細胞可同時進入S期。

3、離心洗脫法離心洗脫法原理是進入細胞周期體枳呈線性增加。Gi期細胞體積最小，

離出口最近而被最先洗出。G：/M細胞體積最大離進氣口最近而被后洗出。

在上述同時化處理尚需配合以同時化程度檢測，檢驗方法有兩種：流式細胞光度技術和

放射性同位素技術。前者經過測定細胞熒光強度來定量細胞DNA量：后者則利用測定摻

入到DNA中咕-胸背（3H-TdR）或浪脫氧尿甘（BrdU）量來獲知處于S期細胞量。

（二）藥品抗微管作用利用微管蛋白在37c聚合，在冰浴上解聚特點，測定微管蛋

白或微管液OD值，分別取得S型聚合曲線和倒S型解聚曲線，比較藥品對曲線影響，用

下式計算抑制率。

試驗組光密度值

抑制率（％）=（1?）X100%

對照組光密度值

（三）藥品和DNA結合能力檢驗

吸收光譜移動法原理是DNA和藥品形成復合物后吸收光譜發生改變，吸收峰產生位

移，位移波長隨DNA/藥品復合物量增加而增加。利用紫外分光光度計進行紫外吸收光譜

掃描，可觀察到這些改變。

熒光光譜移動法原理是在激發光激發下，DNA-藥品復合物熒光發射光譜發生改變，

譜峰向短波方向移動，熒光強度增強，同時激發光譜說發生改變。用熒光分光光度計測定激

發光譜和發射光譜可觀察到這些改變。

（四）藥品造成DNA損傷

彗星（Comet）微凝膠單細胞電泳法正常DNA為負超螺旋結構，在pH<9.0時以雙

徒形式存在，在pH>12.0時則完全解鏈。DNA受損后鏈斷裂，成為一個松散結構,在電場作

用下，松散DNA離開細胞核向正極移動，形成彗星似拖尾，變換不一樣pH緩沖液可檢測斷裂

是雙鏈還是單鏈。

堿洗脫法搜集細胞于濾膜上，用細胞溶解液裂解細胞并洗去RNA和蛋白質，暴露

DNA,用洗脫液進行洗脫，若DNA發生鏈斷裂，則易于經濾膜洗出。

（五）藥品對DNA拓撲異構酶影響

DNA拓撲異構酹是調整DNA空間結構動態改變關鍵性核能，分成拓撲異構酎I和II,

抑制拓撲異構酶【能夠造成DNA單鏈斷裂，抑制拓撲異構酶II,可造成雙鏈斷裂，進而干

擾DNA復制、重組和基因表示。試驗原理是用從腫瘤細胞核提取拓撲異構的II處理

PBR322DNA,后者是一個質粒DNA,關鍵存在有超螺旋、缺口狀和線性DNA三種形式，

瓊脂糖電泳上顯示出三條帶，在拓撲異構酶作用下超螺旋DNA解旋、斷裂，電泳時超螺旋

帶減弱或消失，對應缺口環狀或線性DNA增加。假如藥品對拓撲異構酶含有抑制作用，則

可見超螺旋帶保留。此方法亦可改善為觀察藥品對拓撲異構酶功效促進和抑制作用。方法是

選定不能使一定量DNA完全斷裂量拓撲異構酶處理PBR322DNA后電泳可見超螺旋帶，同

時加入不一樣濃度藥品，假如藥品抑制拓撲異構酶，則超螺旋帶增強，若藥品增強拓撲異構

的活性，則見螺旋帶減弱或消失。

（六）藥品對細胞核酸代謝影響DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素標識

前體物如'H-TdR,3H-UR可分別摻入到細胞DNA和RNA中去，用液閃法測定其同位素

活性則可知細胞DNA和RNA合成情況。

（七）藥品對腫瘤細胞凋亡誘導作用

細胞凋亡是一個受基因調控細胞程序性死亡過程，細胞凋亡時表現為細胞體縮小，染色

質濃縮成大小不等塊狀，并裂解為小片段。DNA斷裂長度為核小體核甘酸長度（180?200

堿基對）整倍數，提取后一般瓊脂糖電泳表現為特殊云梯狀，凋亡小體形成。檢驗細胞凋亡

方法有：

1、熒光顯微鏡形態學檢驗該方法是利用凋亡細胞染色質濃縮，DNA廣泛裂解特征

和熒光化合物可嵌入DNA分子或以靜電相互作用和DNA分子結合原理，建立DNA熒光探

針。常見方法是用Hocchsi33342和PI聯合染色，然后在熒光顯微下用紫外光激發。凋亡細

胞對Hocchst33342含有高攝取比，加之染色質高度濃縮，呈強籃色熒光：正常細胞呈微弱

熒光，壞死細胞則呈紅色熒光（被PI染色）。

2、流式細胞光度術該方法原理是用DNA結合性熒光染料標識DNA,因為細胞發

生凋亡時，內源性核酸內切的降解、斷裂DNA,斷裂生成小分子量DNA溢出細胞外，細

胞內DNA總量降低，利用流式細胞光度術能夠檢測出DNA這種結構和量改變。

3、瓊脂糖電泳分析法利用該方法可檢測出呈云梯狀寡聚核小體。

（g）動物體內藥品代謝動力學試驗

了解受試物在體內吸收、分布和排泄速度和蓄積性，尋求可能靶器它：為選擇慢性毒性

試驗適宜動物種、系提供依據：了解代謝產物形成情況。

范圍

本方法要求了代謝試驗基礎技術要求。

本方法適適用于評價中國創新化學物質，或需要進行三個階段毒性試驗包

括已知化學物質或和已知化學物質結構基礎相同衍生物在體內代謝轉化路徑及轉歸。

原理

受試物在體內可發生?系列兔雜生化改變.受試物經胃腸道吸收后經過血液轉運到全

身各組織器官，再經過生物轉化，由多種路徑排出體學結構，測試其毒性并推測受試物在體

內具體代謝路徑。經過木試驗觀察，對受試物在體外。所以，受試物原形物在逐步被代謝降

解，而其代謝產物不停生成。測定灌胃后不?樣時間內受試物原形物或其代謝物在血液、組

織或排泄物中含量，以了解該受試物在動物體內毒代動力學特征，包含吸收、分布、消除特

點，組織蓄積及可能作用靶器官等，依據數學模型，求出各項毒代動力學參數。同時采取分

離純化方法確定關鍵代謝產物化內過程可作出正確評價，為說明該受試物毒作用性質和程度

提供科學依據。

儀器和試劑

依據試險室條件,配置高效薄層色譜、高效泄相色譜、氣相色譜、氣質聯用及紫外光、熒

光檢測等儀器設備。

放射性測量儀器：液體閃爍計數儀及閃爍液。

試驗室常見儀器和試劑。

試驗動物

標準上應盡可能使用和人含有相同代謝路徑動物種系。通常選擇兩種性別、體重為

22-28g成年小鼠或170-220g大鼠。試驗開始時動物體重差異應不超出平均體重±20%。

劑量及分組

選擇低于最大未觀察到有害作用劑量，需要時可用高、低二種劑量?？蓡未位驍荡谓o受

試物。如采取標識化合物，除確定化學劑量外，放射性劑量通常.小鼠為10-20uCi/只

（0.4-0.8MBq/H）、大鼠100-250口Ci/kg（4-9MBq/只）。

操作步躲

①受試物配制：通常見蒸馀水作溶劑，如受試物不溶于水，可月食用油、醫用淀粉、粉甲基

纖維素配成乳濁液或懸濁液。受試物應于灌胃前新鮮配制，除非有資料表明以溶液（或懸濁

液、乳濁液等）保留含有穩定性。

②給受試物路徑：以灌胃為主，灌胃前動物禁食16-18h,自由飲水。進行毒代動力學分析

時，最好同時采取灌胃和靜脈注射。

③試驗項目：進行代謝試驗前，需建立測定生物樣品中受試物含量微量化學分析方法或

標識受試物同位素示蹤方法。

a.血漿中受試物含量或放射性水平測定：于動物灌胃后6-10個不一樣時相采血，每

個時相動物數不應少于3只。結果以每mL血漿中受試物含量或放射性強度為縱坐標，時

間為橫坐標，在半對數紙上作藥-時曲線。如以化學分析方法測定受試物含量，用已編制藥

代動力學計算機程序進行曲線擬合，按房室模型求出毒代動力學方程及各項代謝動力學參

數。如用同位素示蹤法測定血漿總放射性水平，作代謝動力學分析時應謹慎。

b.胃腸道吸收：于灌胃后不?樣時間處死動物，取出胃腸道及其內容物（包含糞）作成勻漿,

測定受試物含量或放射性水平，以灌胃后立即處死動物胃腸道回收量為100%,分別觀察不

一樣時相各組動物中受試物或放射性自胃腸道消失情況。以上述不一樣時相回收量百分數為

縱坐標，時間為橫坐標，在半對數紙上作圖，求得受試物或放射性在胃腸道消失速率。為確

定受試物在胃腸道消失速率是否能反應在體內吸收情況，需進行離體胃腸道溫孵試驗，立即

受試物注入離體胃腸道后結扎兩端，于37℃Kreb's液中振蕩溫孵lh,測定受試物回收率,

以觀察受試物在胃腸道內有沒有受到破壞，由此估量受試物在胃腸道吸收速率。

c.關鍵器官和組織中分布：于程胃后取-.!個不一樣時相處死動物，對肝、腎、腦等器官

和組織進行受試物含量或放射性測定，以找出受試物含量最高組織和時間。

d.排泄

⑴尿、糞排泄：給動物灌胃受試物后放入有機玻璃代射籠內，于3-7天內按要求時間搜集尿

和糞。如發覺尿糞互混，則把標本棄去再另搜集。作代謝產物結構分析時應把收尿容器放在

冰浴中并注意避光。

⑵膽汁排泄：輕度乙酸麻醉下給動物施行膽道插管，待動物清醒后以受試物灌胃，搜集

不一樣時間膽汁（不少于24h）。

從不一樣時間搜集尿、糞、膽汁標本中受試物含量或放射性強度，分別計算其累積排出

量（占灌胃劑量百分數）。

e.生物轉化：按受試物化學結溝和文件資料，估量可能產生代謝產物。給動物以受試物后，

搜集尿、膽汁等標本，或在體外代謝條件下采取肝微粒體、酹活性系統和受試物于37c振

蕩培養，以提取、純化后進行代謝物結構判定。分析手段包含薄層色譜、氣相色譜、液相色

譜、質譜、紅外光譜等。要有估計代謝物純品作標準。如采取標識化合物，樣品經薄層色譜

分離后用放射性薄層掃描儀或分段刮下硅膠測定放射性，由Rf值判定并測量受試物量及可

能代謝產物，再作深入分析。從代謝物分離和判定，對受試物在體內可能代謝路徑作出推斷。

④同位素試驗中注意事項：同位素方法是毒物代謝試驗中不可缺乏手段之一，常列為首選試

驗方法，它含有靈敏度高、樣品制備較簡單、不易受生物材料中雜質干擾，能夠示蹤觀察受

試物進入體內后歸宿等優點,結合化學分析法如薄層色譜、液相色譜法，可把原形物和代謝

物分開以初步確定代謝物可能存在形式。用放射自顯影法可定位觀察受試物和代謝產物在整

體動物或一些組織中分布定位。

a.標識化合物要求

⑴標識核素：由試驗目標、受試物分子結構、半衰期、經費等原因而定。

⑵標識位置：應標識在受狀物結構中含有生物活性基團上，即定位標識.如生物活性基

團不清楚，由可采取均勻標識或全標識。標識位置在化學結構上應是穩定。按不一樣研

究目標，可單標識、雙標識或多標識。

⑶放射化學純度：標識物應確保高度放化純度（最少90%以上），必需時用薄層色譜

法進行純化。

⑷放射性比度：隨受試物毒性大小而定。毒性大受試物，要求高放射性比度標識物。用

非標識受試物稀釋配制成試驗所要求化學劑量。

b.放射性樣品測量：代謝試驗常見標識放射性核素大全部屬軟8射線，測量食品關鍵

為液體閃爍計數儀。

⑴樣品制備：酸消化法。組織0.1g、血漿0.1mL、糞混勻液0.1mL（糞加水制成勻漿液，

或糞紅外燈烘干后研磨成粉，稱0.1g）兩份，加高氯酸0.2mL,過氧化氫0.4mL和正辛

醇一滴，

80C水浴消化45min,加蒸儲水定容至1mL,取出0.1mL,加入3?5mL閃爍液進行放射

性測量（膽汁、尿離心后可直接取樣測量）。有條件者可用固體閃爍晶體。

⑵樣品測量法：均相測量法。樣品經淬滅校正后，以每克組織或每亳升血漿中每min放

射性衰變數(DpM)表示。

⑶放射性測量誤差：放射性測量相對標準誤差應不超出5-10%?

c.遵守放射性衛生防護操作規程。

⑤對生物樣品中受試物分析方法要求：建立一個靈敏、特異、重現性好測定方法。

結果判定

①依據吸收速率、組織分布和排泄情況，估量受試物在體內代謝速率和蓄積性。

②依據關鍵代謝物結構及性質，推斷受試物在體內可能代謝路徑和有沒有毒性代謝物生成情

況。

(h)動物亞急性，長毒試驗

了解經長久接觸受試物后出現毒性作用和致癌作用：最終確定最大未觀察到有害作

用劑量和致癌可能性，為受試物能否應用于保健食品最終評價遇供依據。

慢性毒性試驗所得最大未觀察到有害作用劑量進行評價標準是：

①最大未觀察到有害作用劑量小;或等r人可能攝入量5。倍者，表不毒性較強，應放棄該

受試物。

②未觀察到有害作用劑量大于50倍而小于100倍者，經安全性評價后，決定該受試物是否

可用。

③最大未觀察到有害作用劑量大于或等于100倍者，則可考慮并可使用。

范圍

本方法要求了慢性毒性和致癌試驗基礎技術要求。

術語和定義

最大未觀察到有害作用劑量(NOAEL)：是指經過動物試驗，以現有技術手段和檢測指

標未觀察到和受試物相關毒性作用最大劑量。

靶器宮：試驗動物出現由受試物引發顯著毒性作用任何器官。

致癌性：試驗動物每日反復暴露于受試物造成腫瘤發生。

慢性毒性：試驗動物長久每日反復暴露于受試物出現有害作用。

原理

在動物大部分生命期間，經過反復給受試物后觀察其展現慢性毒性作用及其劑量-反應

關系，尤其是進行性不可逆毒性作用及腫瘤疾患。并確定受試物未觀察到有害作用劑量，作

為最終評定受試物能否應用于保健食品依據。

試驗動物

①動物種類選擇：標準匕宜選擇