37Real-timefluorescencequantitativeRT-PCR/PCRdetectiontechniqueforfoot-and-mouthdiseasevirus,bovineviraldiarrheavirusandrhinotracheitisvirusinaerosoloflarge-scalecattlefarms2021-12-27發布I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。1規模化牛場氣溶膠中口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒實時熒光定量RT-PCR/PCR檢測技術規程GB/T6682分析實驗室用水規格和GB/T27401實驗室質量控制規范動物4縮略語25.1除非另有說明，在檢測中使用的試劑均為分析純，水應符合GB/T5.2體積比25:24的酚：氯仿溶液，應2℃~8℃保存見A.1。5.3體積比24:1的氯仿：異戊醇溶液，應2℃~8℃保存見A.2。5.7TE緩沖液，配制見A.6。錄B。6.4冰箱，2℃~8℃和-20℃兩種。應用空氣微生物采樣箱，使用國際標準的AGI采集樣本。樣品采集后立即用1%甲醛溶液滅活處理。3所提取物為氣溶膠采集液，可能含有病毒。操作者必須帶口罩和一次性手套，RNA提取盡量在人少），可采用經驗證的病毒RNA提），13000r/min、15min，取上），可采用經驗證的病毒核酸提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提避免移液器取樣損失，建議按n+1個反應配制，計算好各試劑的使用量，加入一適當體積小管中，充分4在樣品處理區進行。分別向上述PCR管中加入樣本核酸提取步驟中制備的RNA溶液5μL和9結果判定9.1結果分析條件的設定9.2質控標準9.3結果判定檢測通道均無Ct值，且無特征性擴增曲線，9.3.3可疑5溶液配制取Tris-飽和酚有機相（下層溶液）50mL和氯仿48mL混勻，2℃~8℃保存。取氯仿48mL和異戊醇2mL混勻，2℃~8℃保存。A.30.5mol/LTris-HCl(pH稱取6.055gTris置于100mL燒杯中，加A.40.5mol/LEDTA（pH加0.1%DEPC水定容至50mL，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存。A.72mol/LNaAc（PH5.6ATGACACAGGAAAACATTCCFermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進行反轉錄cDNA。以cDNA為模板7/30sec，72℃/30sec，33個循環；第三階段，72℃/5min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的取牛病毒性腹瀉病毒細胞培養物200μL，參照7.2.1提取病毒RNA，RNA按照FermentasReverFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進行反轉錄cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應液見序結果BLAST比對同B.3，正確的重組質粒命名為pEAST-T3-BVDV，作為檢測牛病毒性腹瀉病毒的陽性質B.5牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒標取牛傳染性鼻氣管炎病毒的細胞培養物200μL，參照7.2.2提取病毒DNA。以牛傳染性鼻氣管炎病載體克隆、重組質粒篩選、DNA測序及測序結果BLAST比對同B.3，正確的重組質粒為陽性，將其命名為pEAST-T3-IBRV，作為檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的陽性質粒標準8空氣微生物采樣箱，Porton空氣微生物采樣器，三），設備安裝：首先安裝三腳架，空氣微生物采樣器放置高度為距地面1.5m，將30mL滅菌氣口上，另一端連接到Porton空氣微生物采樣器收集參數：采用液體沖擊式采樣方式，采樣流量為12.5L/min，采樣時間為30min。收集標準：每個牧場一般在產房、動物房、運動場和奶廳4個位置樣品的滅活處理與分裝：氣溶膠采樣器采集結束后，直接將30mL樣本收集到50mL離心管內，采樣送往有條件的實驗室進行熒光定量PCR檢測，采集的兩份樣品，一份用于直接檢測，另一份-20℃保存氣溶膠現場采集完畢