CCSXXXXDB51準TechnicalcodeofpracticeforkiwifruitmalepollenkillingPseudomonassyringaepv.IDB51/TXXXX—XXXX 2規范性引用文件 3術語和定義 3.1 4雄株園建設 24.1品種選擇 24.2建園要求 25雄株園管理 25.1整形修剪 25.2肥水管理 36雄株生長期潰瘍病防控 6.1藥劑選擇 36.2施藥時間 37獼猴桃雄花蕾采集與殺潰瘍病菌處理 7.1雄花蕾采集 37.2待加工雄花蕾臭氧脫菌處理 48獼猴桃雄花粉生產 48.1器具消毒 4DB51/TXXXX—XXXX8.2花粉提取 48.3花粉保存及運輸 49脫菌處理雄花粉質量檢測 49.1待檢測花粉抽樣 49.2雄花粉質量要求及活力檢測 49.3雄花粉帶活菌檢測 410結果記錄與資料保存 5附錄A 9 參考文獻 DB51/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由四川省市場監督管理局提出、歸口并解釋。本文件起草單位：四川農業大學、四川省農業科學院園藝研究所、都江堰獼多多農業科技有限公司、都江堰市農業農村局、廣元市農業科學研究院聯合提出。本文件主要起草人：龔國淑、姚凱凱、馬苗苗、唐合均、周佳佳、陳華保、吳翠平、涂美艷、何成勇、王玲利、晏志強、康超勇、雷彬。DB51/TXXXX—XXXX1獼猴桃雄花粉脫除潰瘍病菌生產技術規程本文件規定了四川省內獼猴桃雄株園建設與管理，雄株生長期潰瘍病防控，雄花蕾采集與殺潰瘍病菌處理，經脫菌處理技術生產的雄花粉攜帶潰瘍病菌檢測等方面的內容。本文件適用于四川省內獼猴桃栽培區域。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T2828.1-2012計數抽樣檢驗程序（第1部分）GB/T6682-2008分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T8321.10農藥合理使用準則（十）DB51/T3069-2023獼猴桃主要病蟲害綠色防控技術規程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1獼猴桃雄花粉kiwifruitmalepollen獼猴桃雄株花朵的花藥經加工散出的單倍體雄性生殖細胞，通常為淡黃白色或灰白色粉末。3.2待加工獼猴桃雄花蕾kiwifruitmalebudtreatmentbeforepollenproduction將萼片已開裂膨大且處于含苞待放（大蕾期）的獼猴桃雄花蕾采集后，經陰干等處理，加工前達到符合生產花粉要求的獼猴桃雄花蕾。DB51/TXXXX—XXXX23.3脫菌處理operationofkillingPseudomonassyringaepv.actinidiae在不影響花粉活力的情況下，利用殺菌劑或臭氧對待加工獼猴桃雄花蕾攜帶的獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonassyringaepv.actinidiae，簡稱Psa）進行滅活處理的操作。3.4雄花粉活力kiwifruitmalepollenparticlesactivity雄花粉具有萌發長出花粉管并與雌配子結合完成受精的能力，花粉管的長度超過花粉粒直徑為萌發的花粉，反之為不萌發的花粉。用離體培養條件下的萌發率評價花粉的活力。3.5帶活菌檢測viablePsadetectionofkiwifruitmalepollen對所生產的雄花粉進行是否帶活的獼猴桃潰瘍病菌的抽樣檢測操作。4雄株園建設4.1品種選擇4.1.1應選擇廣適性好、花量大、出粉多、抗潰瘍病強的美味獼猴桃或中華獼猴桃雄株品種。4.1.2應選用抗澇耐旱型專用砧木。4.2建園要求4.2.1新建園栽植株行距宜（1.5～3.0）m×（3.0～3.5）m。用雌株生產園高接換種改建雄株園時，如原株行距過大，應在株間或行間適當補植新苗木。4.2.2藤蔓棚架應選用T型架或水平棚架。周邊應配置防風林或擋風墻，高度不低于5.5m。5雄株園管理5.1整形修剪5.1.1根據立地條件和栽植株行距選擇合理樹形，包括單主干單主蔓十側蔓、單主干雙主蔓二十側蔓或單主干無主蔓多側蔓等。DB51/TXXXX—XXXX35.1.2雄株冬季修剪宜輕，采花后7d內重剪一次。修剪過程中每剪一株樹須用75%酒精對修剪工具、剪鋸口進行消毒，修剪傷口應涂抹保護愈合劑。5.2肥水管理5.2.1幼樹期肥水管理應遵循勤施薄施原則。5.2.2進入大量產花年份后，每年采花后至7月初應以高氮型復合肥為主，7月中旬至9月下旬應以均衡型復合肥為主，10月施基肥一次、以腐熟有機肥為主。6雄株生長期潰瘍病防控6.1藥劑選擇6.1.1應選用中生菌素、梧寧霉素、氫氧化銅、春雷·王銅、春雷霉素、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等進行防治。6.1.2農藥使用應符合GB/T8321.10的規定。6.1.3藥劑使用濃度以說明書為準。6.2施藥時間6.2.1冬剪后（休眠期至萌芽前），做好冬季清園工作并全園施用1次波美3~5度石硫合劑。6.2.2絨球期選用6.1.1藥劑種類均勻噴施主干及側枝，以枝干表面均勻形成一層水膜為宜。6.2.3現蕾期至采花前，全園噴施藥劑1~2次，間隔期約7d，著重噴施雄花蕾及花梗，以雄花蕾表面均勻形成一層水膜為宜。采摘雄花蕾前5d內施完最后1次藥。6.2.4全園雄花蕾采完后，7d內全園施藥1次。6.2.5落葉前，全園施藥1~2次，施藥間隔期為7~10d。6.2.6潰瘍病以外的其他病蟲害防控參照DB51/T3069-2023執行。7獼猴桃雄花蕾采集與殺潰瘍病菌處理7.1雄花蕾采集DB51/TXXXX—XXXX4花蕾萼片開裂且膨大處于含苞待放的大蕾期時采集，采集時不應用金屬容器盛裝。自花朵采摘離樹運輸至加工場所時間不應超過5h。7.2待加工雄花蕾臭氧脫菌處理將運輸至加工場所的雄花蕾采用鼓風干燥或經自然陰干，充分除去表面水分后即待加工獼猴桃雄花蕾，裝入帶有臭氧發生器的密閉容器內，雄花蕾量以達1/3容器為宜。臭氧濃度為630mg·m-3~650mg·m-3密閉處理15min~20min，處理過程中連續緩慢滾動容器。8獼猴桃雄花粉生產8.1器具消毒每批次花粉加工前，對所有雄花粉加工器具表面噴75%的酒精消毒后備用。8.2花粉提取從花藥分離、干燥到花粉的收集全過程按花粉生產常規技術操作進行。8.3花粉保存及運輸長期保存應在低于-40℃速凍密封貯藏，出貯藏室采取逐級升溫。臨時保存或運輸過程中應在0℃~5℃干燥條件下進行，并注意減少溫度變幅；臨時保存和運輸時應防熱、防潮、防碰撞和擠壓。9脫菌處理雄花粉質量檢測9.1待檢測花粉抽樣同一次采集、加工的花粉為一個批次。每批次抽樣按照GB/T2828.1-2012的規定執行。9.2雄花粉質量要求及活力檢測雄花粉質量及授粉要求、活力檢測方法詳見附錄A、附錄B。9.3雄花粉帶活菌檢測雄花粉帶活菌檢測方法及判定結果詳見附錄C、附錄D。DB51/TXXXX—XXXX510結果記錄與資料保存實驗記錄應包括：樣品來源、種類(品種)、采集時間、檢測時間、地點和結果等，主要要有檢測人員、審核人員簽字。上述材料應歸檔并妥善保存2年以上。DB51/TXXXX—XXXX6附錄A（資料性附錄）雄花粉質量及授粉要求A.1感官指標分離獲得的獼猴桃雄花粉呈粉末狀、易分散，無霉變結塊，無可見雜質。A.2花粉產品等級指標按雄花粉純度及雄花粉活力（以花粉萌發率表示）劃分等級。表A.1雄花粉產品質量等級指標70（含9060（含8060（含7040（含60A.3不同品種雄花粉授粉適用性參考表表A.2不同類型獼猴桃雄花粉授粉適用雌株參考表DB51/TXXXX—XXXX7（資料性附錄）雄花粉活力檢測方法B.1感官檢驗在無直射陽光下，用感官檢驗雄花粉顏色、形狀等。B.2試劑、用具與儀器試劑：蔗糖、硼酸、蒸餾水、瓊脂；用具：燒杯、量筒、玻棒、載玻片；儀器：顯微鏡、0.001g電子天秤、電爐、生化培養箱。B.3分析實驗室用水規格按照GB/T6682-2008的規定執行。B.4培養基制備準確稱取10g蔗糖、0.015g硼酸、1g瓊脂、100ml蒸餾水，全部倒入燒杯中，放到電爐上加熱并不斷攪拌至完全溶解，補足水分，備用。B.5待檢測樣品的制備將同一個花粉包裝單元內的花粉充分混合均勻后，用取樣勺取少量（約30mg）制成待檢測花粉樣品。冷藏花粉在室溫條件下放置4h后再充分混合取樣進行檢測。B.6載玻片制備用吸管或玻棒吸取熱培養基4～5滴，滴在平放的載玻片中心位置，待培養基自然擴散冷凝，備用。B.7花粉接種用毛發蘸取待檢測花粉樣品，均勻播種在載玻片培養基上，然后將接種好的載玻片放在鋪了濕紙巾的培養皿內。每個樣品重復3次。B.8花粉培養將接種好的花粉培養皿置于25℃生化培養箱內暗培養2h~8h。一般現制備的花粉萌發需時短，冷藏的花粉需時稍長，應間隔一定時間取出檢查萌發情況，以花粉管長度超過花粉粒直徑視為萌發。B.9觀測統計DB51/TXXXX—XXXX8將載玻片取出放在顯微鏡下（10×10）觀測。每個樣品至少觀測15～20個視野畫面，在占多數的畫面中（超過70%）選取3個畫面進行拍照和活力統計。活力計算方法按DB61/T888執行。B.10活力值確定每一份樣品都需要做3次重復檢測，每一次檢測都可拍3個畫面，每一個畫面對應一個活力值，樣品最終活力值取9個活力值的平均值。B.11純度檢驗檢測儀器與用具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種針。樣品制備：用接種針取少量花粉于載玻片上，蓋上蓋玻片。B.12純度統計在100倍的顯微鏡下觀察花粉樣品，至少觀察3個載玻片，每載玻片觀察3個視野，分別記錄每個視野的花粉和非花粉物質比例。純度計算方法按DB61/T888執行。B.13出廠檢驗花粉應經出廠檢驗合格，方可出廠；出廠花粉應附合格標記。花粉出廠檢驗項目為感官指標、活力、純度和凈含量。花粉的出廠檢驗項目全部合格判為出廠檢驗合格品；在檢驗中有一項指標不符合本文件要求，應加倍抽樣進行復檢，復檢中有一項不合格，即判定為不合格產品。B.14型式檢驗在下列情況之一時，進行型式檢驗，型式檢驗為全項檢驗：花粉原料發生變化時；花粉采集、加工程序有變化時；正常生產時每年進行一次；和用戶發生質量爭議需要仲裁時；有關質量監督部門提出型式檢驗要求時。型式檢驗的樣品應在出廠檢驗合格批中抽取。B.15判定規則型式檢驗的項目全部合格，判該批花粉為合格品；若有一項不合格，應加倍抽樣，重新檢驗，若還有一項不合格，判該批花粉為不合格品。DB51/TXXXX—XXXX9（資料性附錄）獼猴桃雄花粉帶潰瘍病菌（活菌）常規檢測方法C.1制備待檢測樣品溶液超凈工作臺內準確稱取待測花粉樣品0.5g，加入裝有5mL無菌水的離心管中（內有適量玻璃珠迅速震蕩待花粉完全分散于水中，制成1:10的樣品溶液，2000r/min離心2min后，無菌環境下吸取上清液至新的無菌離心管內，即為待檢測樣品溶液。C.2平板涂布法活菌檢測C.2.1梯度稀釋取C.1中經離心后的待檢測樣品溶液1mL，加入到9ml無菌水中，連續梯度稀釋，分別制成10-2、10-3、10-4或其它合適稀釋度的樣品液。C.2.2LB平板計數無菌條件下各取200μL不同稀釋度的樣品待檢測液，均勻涂布于固體LB平板培養基上，每個濃度梯度重復5次。待平板上的樣品檢測液完全干燥后，25℃倒置培養48h。觀察菌落形態，與Psa病原菌形態特征比較。LB平板上Psa菌落呈圓形、乳白色、表面光滑、邊緣整齊。病原菌生長最適溫度為25℃-28℃,培養24h后便可長出菌落。生長最高溫度為35℃,生長最低溫度為-12℃以下，致死溫度為55℃。C.2.3直接PCR檢測C.2.2中每個平板疑似Psa菌落30個以內的全選，30-100個/板則隨機挑取30個疑似菌落進行PCR檢測確認。PCR檢測所用引物對、反應體系及反應程序如下：引物對1:Psa-F1/R2（正向引物：5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'、反向引物：5'-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3，擴增片段長度為280bp)；引物對2（Psa3類群特異性引物HopZ5-F/R（正向引物：5'-TCACTCCTAGACTGGAATAC-3'，反向引物：5'-GGCTATCATGAAGGCTGTCA-3'，擴增片段長度為550bp）。使用前用無菌ddH2O將合成的引物干粉稀釋成10μmoL/L儲存液。PCR擴增反應體系：2×TaqMastermix12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，加ddH2O補足到25μL，無菌牙簽挑取單菌落少許作為模板，混勻瞬時離心后進行PCR反應。DB51/TXXXX—XXXXPCR擴增程序：將配制完成的反應管放入PCR儀中，Psa-F1/R2引物對反應程序為：94℃4min，94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35個循環，72℃10min，4℃保存；HopZ5-F/R引物對反應程序為：94℃4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35個循環，72℃10min，4℃保存。PCR產物檢測：擴增結束后取5μLPCR產物于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，電泳結束后在凝膠成像系統下觀察并成像，比對是否獲得目標片段。陽性對照與陰性對照：用已知的Psa標準菌株作為陽性對照；無菌ddH2O作為空白對照。C.3結果判定若待測樣品和陽性對照存在280bp條帶/550bp條帶，陰性對照和空白對照無此條帶，則判定待測花粉樣品為陽性即攜帶有活菌，否則為陰性。DB51/TXXXX—XXXX（資料性附錄）PMA-PCR雄花粉帶活菌檢測相關資料D.1PMA名稱疊氮溴化丙錠（propidiummonoazide，PMA）D.2PMA檢測活菌原理疊氮溴化丙錠（propidiummonoazide，PMA）是一種光反應的DNA結合染料，具有極高的DNA親和結合能力，PMA可進入死亡和外膜損傷嚴重的微生物內部，并插入DNA結構中，經可見光刺激發生光裂解后，同DNA結合發生共價交聯反應，共價交聯產物可以抑制DNA的PCR擴增。D.3PMA濃度向規格為1㎎/瓶的PMA試劑中加入1mL二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide）充分溶解，4℃條件儲存備用。D.4PMA處理程序取溶解后的PMA試劑10.5μL，加入體積為90μL已制備好的樣品待檢測液中（C.1迅速混勻后，黑暗（避光）室溫孵育8min后，再置于強光（500W鹵素燈光）下照射20min，用于后續DNA提取。D.5熱裂解法制備DNA模板及PCR檢測方法將D.4中經PMA處理后的樣品待檢測液于12000r/min離心5min，棄上清液，再加入1ml無菌ddH2O，充分震蕩后100℃條件下置于金屬浴中熱裂解10min，再經冰浴冷卻后，12000r/min離心5min，棄去上清液；按1:10的比例用ddH2O進行稀釋即為DNA模板；取2μLDNA模板進行PCR檢測。PCR制樣、檢測方法如下：PCR擴增反應體系：取2μLDNA作為模板，2×TaqMastermix12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，加ddH2O補足到25μL，混勻瞬時離心后進行PCR反應。PCR擴增程序：將配制完成的反應管放入PCR儀中。Psa-F1/R2引物對反應程序為：94℃4min，94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35個循環，72℃10min，4℃保存；HopZ5-F/R引物對反應程序為：94℃4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35個循環，72℃10min，4℃保存。PCR產物檢測：擴增結束后取5μLPCR產物于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，電泳結束后在凝膠成像系統下觀察并成像，比對是否獲得目標片段。DB51/TXXXX—XXXX陽性對照與陰性對照：用經PMA處理過的Psa標準菌株作為陽性對照，經高溫高壓滅菌處理后死的Psa標準菌株作為陰性對照，無菌ddH2O作為空白對照。D.6結果判定若待測樣品和陽性對照存在280bp條帶/550bp條帶，陰性對照和空白對照無此條帶，則判定待測花粉樣品為陽性即攜帶有活菌，否則為陰性。DB51/TXXXX—XXXX參考文獻[1]T/DJYMHT0001-2023獼猴桃雄花粉生產與質量控制技術規程.[2]T/DJYMHT0001-2024獼猴桃雄花粉脫除潰瘍病菌生產技術規程.[3]龔國淑,李慶,張敏,等.獼猴桃病蟲害原色圖譜與防治技術[M].北京:科學出版社.2020.[4]涂美艷,祝進.圖說紅肉獼猴桃豐產優質高效栽培技術[M].北京:中國農業科學技術出版社.2022.[5]李黎,馮丹丹,潘慧,等.獼猴桃花粉滅菌方法比較及對果實品質的影響[J].園藝學報,2022,49(4):769-777.[6]胡月,陳航,楊巽喆,等.酶聯免疫吸附反應對獼猴桃潰瘍病菌效應子Hopz5多克隆抗體的特性分析[J].生物技術通報,2018,34(1):84-89.[7]肖妍,劉蕓宏,高貴田,等.PMA-qPCR方法檢測陜西獼猴桃潰瘍菌優勢病原菌活菌的研究[J].食品與機械,2019,35(4):48-53+59.[8]StefaniEandGiovanardiD.DisseminationofPseudomonassyringaepv.actinidiaethroughpollenanditsepiphyticlifeonleavesandfruits[J].PhytopathologiaMediterranea,2011,50(3):489-496.[9]FlayC,SymondsVV,StoreyR,etal.Map**QTLassociatedwithresistancetoPseudomonassyringaepv.actinidiaeinkiwifruit(Actinidiachinensisvar.chinensis)[J].FrontiersinPlantScience,2024,14:1255506.[10]VannesteJL.Thescientific,economic,andsocialimpactsoftheNewZealandoutbreakofbacterialcankerofkiwifruit(