第八章生物信息學在基因芯片中應用主講人：孫嘯制作人：劉志華東南大學吳健雄試驗室第1頁生物信息學和基因芯片是生命科學研究領域中兩種新方法和新技術，生物信息學與基因芯片親密相關，生物信息學促進了基因芯片研究與應用，而基因芯片則豐富了生物信息學研究內容第2頁第一節概述１、基因芯片介紹第3頁（１）基因芯片基本原理及生物信息學作用

基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成探針陣列，其工作基本原理是經過雜交檢測信息。基因芯片把大量已知序列探針集成在同一個基片上，經過標識若干靶核酸序列經過與芯片特定位置上探針雜交,便可依據堿基互補匹配原理確定靶基因序列。第4頁依據探針類型和長度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長DNA探針（

100mer）芯片這類芯片探針往往是PCR產物，經過點樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA表示分析。另一類是短寡核苷酸探針芯片其探針長度為25mer左右，普通經過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA表示監控，也能夠用于核酸序列分析。第5頁

原理--經過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組互補序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA第6頁基因芯片熒光標識樣品共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象雜交結果分析探針設計雜交第7頁第8頁（２）基因芯片制備基因芯片制備主要有兩種基本方法:一是在片合成法，在片合成法是基于組合化學合成原理,它經過一組定位模板來決定基片表面上不一樣化學單體偶聯位點和次序。在片合成法制備DNA芯片關鍵是高空間分辨率模板定位技術和固相合成化學技術精巧結合。另一個方法是點樣法。基因芯片點樣法首先按常規方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后經過特殊針頭和微噴頭,分別把不一樣探針溶液，逐點分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不一樣位點,并經過物理和化學結合使探針被固定于芯片對應位點。第9頁（３）靶基因樣品制備及芯片雜交依據基因芯片檢測目標不一樣,能夠把樣品制備方法分為用于表示譜測量mRNA樣品制備用于多態性(或突變)研究基因樣品制備第10頁（４）雜交信號檢測對于用熒光素標識經擴增（也可用其它放大技術）序列或樣品，與芯片上探針進行雜交，然后沖洗，采集熒光圖像。圖像采集用落射熒光顯微鏡或電荷偶聯裝置攝影機非共聚焦激光掃描儀等進行。第11頁２、基因芯片對于生物分子信息檢測作用和意義在生命科學領域中，基因芯片為分子生物學、生物醫學等研究提供了強有力伎倆。利用基因芯片技術，可碩士命體系中不一樣部位、不一樣生長發育階段基因表示，比較不一樣個體或物種之間基因表示，比較正常和疾病狀態下基因及其表示差異。基因芯片技術也有利于研究不一樣層次多基因協同作用生命過程，發覺新基因功效，碩士物體在進化、發育、遺傳過程中規律。第12頁３、基因芯片研究和應用中所包括到生物信息學問題提取什么信息怎樣提取信息怎樣處理和利用信息確定芯片檢測目標芯片設計數據管理與分析第13頁探針設計處理雜交條件一致性問題芯片優化提升芯片制備效率公共數據庫專用數據庫確定目標選擇待檢測目標序列數據分析分析雜交檢測結果及可靠性基因芯片數據庫圖像處理數據庫查詢序列分析生物信息學數據挖掘數據可視化雜交檢測圖像基因芯片數據流圖第14頁（２）生物信息學在基因芯片中應用生物信息學在基因芯片中應用主要表達在三個方面:確定芯片檢測目標芯片設計試驗數據管理與分析第15頁（３）基因芯片研究與應用中所要處理信息學問題在基因芯片信息學方面要處理以下幾個關鍵問題:第一是芯片設計問題第二是可靠性分析問題第三是數據挖掘問題第16頁第二節基因芯片設計１、基因芯片設計普通性標準基因芯片設計主要包含兩個方面:(1)探針設計指怎樣選擇芯片上探針(2)探針在芯片上布局指怎樣將探針排布在芯片上。第17頁確定芯片所要檢測目標對象查詢生物分子數據庫取得對應DNA序列數據序列對比分析找出特征序列，作為芯片設計參考序列。數據庫搜索得到關于序列突變信息及其它信息。第18頁在進行探針設計和布局時必須考慮以下幾個方面：(1)互補性

(2)敏感性和特異性

(3)容錯性(4)可靠性(5)可控性(6)可讀性第19頁２、DNA變異檢測型芯片與基因表示型芯片設計對于DNA序列變異分析，最基本要求是能夠檢測出發生變異位置，深入要求是能夠發覺發生了什么樣改變。從雜交單堿基錯配區分能力來看，當錯配出現在探針中心時，區分能力強，而當錯配出現在探針兩端時，區分能力非常弱。所以，在設計檢測DNA序列變異探針時，檢測改變點應該對應于探針中心，以得到最大分辨率。第20頁３、cDNA芯片與寡核苷酸芯片設計cDNA芯片設計關鍵在于數據庫建立和數據庫信息利用以及各種文庫建立。cDNA芯片制備方法普通采取點樣法，多用于基因表示監控和分析。寡核苷酸芯片制備普通采取在片合成方法。優化是寡核苷酸芯片設計一個主要步驟，包含探針優化和整個芯片設計結果優化。第21頁４、寡核苷酸探針優化設計第22頁第23頁５、基因芯片布局雜交模式探針布局圖Target

TCCGTTAGCTGACTGCAGCTT

G變異第24頁５、基因芯片布局基于Tm值梯度場布局方法

第25頁凸點均勻分布布局方法第26頁（a） (b)凸點均勻分布優化結果示意(a)優化前；(b)優化后。第27頁６、基因芯片優化高密度寡核苷酸芯片設計結果是形成芯片合成方案和步驟，產生制作掩膜板CAD文件。高密度基因芯片制備一個關鍵是掩膜板技術，利用掩膜板進行定位并控制探針在片合成，從而得到很高探針密度。不過制作掩膜板代價較高，為了盡可能地提升基因芯片制備效率，需要對設計好基因芯片進行優化，以降低制備芯片所需要掩膜板個數，同時也降低芯片探針循環合成次數，這對于基因芯片應用有著主要意義。第28頁第29頁第30頁第三節基于芯片序列分析１、測定未知序列早期基于芯片雜交序列分析試驗中，芯片上探針是長度為k（普通為8）全部寡核苷酸組合。這是一個完備探針集合，依據互補關系，經過各個探針雜交結果確定DNA靶序列中存在全部k長度片段，形成靶序列k長度片段譜，然后依據這些片段重構靶序列。第31頁第32頁２、直接檢測目標序列在同一塊芯片上設計多組探針，每一組探針分別檢測一條目標序列，探針長度在20到30之間。普通要求同一組探針之間相互獨立，盡可能不重合或少重合，以提升探針敏感性和特異性。第33頁３、DNA序列突變檢測分析有兩種方法能夠進行已知突變點分析:一個方法是對于目標序列上已知突變點，以該點為中心，從目標序列選取一個片段，作為設計探針參考序列。依據參考序列，分別設計四個高度特異探針，這四個探針除中心位置外均相同并與參考序列互補另一個方法是對于目標序列上已知突變點，分別設計四組探針，其中每一組探針分別檢測一個核苷酸替換。同一組中各個探針長度相同，相互之間交疊，而且每個探針均覆蓋對應突變點。第34頁第35頁４、基因型和多態性分析在同一物種不一樣種群和個體之間，有著各種不一樣基因型，這往往與個體不一樣性狀和各種遺傳性疾病有著親密關系。經過對大量含有不一樣性狀個體基因型進行比較，就能夠得出基因與性狀關系。第36頁為了進行SNPs研究，發覺目標序列上可能出現改變，最直接方法就是依據已知目標序列設計一系列寡核苷酸探針，其中每一個探針用于檢測目標序列特定位置上核苷酸是否發生改變，探察位置位于探針中心。這種方法又稱等長等覆蓋移位法第37頁

第二種方法為單核苷酸分析法。針對目標序列每個位置上全部可能出現改變設計對應探針。第38頁第四節基于芯片基因功效分析１、基因表示分析基因表示是依據基因DNA模板進行mRNA和蛋白質合成過程，各種基因表示存在差異，一個組織中基因表示水平差異可達1萬倍。功效基因研究一個主要方法就是采取高通量基因表示檢測技術，全方面分析基因表示水平，了解基因功效。第39頁２、高密度基因表示芯片第40頁３、基因表示圖譜基于芯片表示監控試驗產生大量數據，在這些數據背后隱藏著豐富基因相互作用、基因功效信息，需要經過細致數據分析揭示這些信息，得到有益結果這種依據基因芯片取得新表示圖譜有別于以前物理圖和功效圖，它能夠更為直接地揭示基因組中各基因相互關系。第41頁４、尋找基因功效

DeRisi等應用酵母cDNA基因芯片研究在有絲分裂和孢子狀態下基因轉錄和表示水平差異。Affymetrix企業制備酵母基因表示型芯片，包含酵母基因組開放讀碼框中260000個25mer探針陣列。Wodicka等采取這種基因芯片對不一樣生活狀態下酵母細胞基因表示進行了研究。第42頁第五節基因芯片檢測結果分析１、熒光檢測圖像處理基因芯片與樣本雜交以后，用圖像掃描儀器捕捉芯片上熒光圖像。在計算機中，一幅圖像由二維象素點所組成，通慣用一個8-bit整數存貯象素點灰度值，取值范圍為[0,255]，其中0代表“黑”，255代表“白”。第43頁一個理想基因芯片圖像含有以下幾個性質：（1）芯片單元形狀和尺寸相同；（2）每個單元中心位于象素點上；（3）無灰塵等引發噪聲信號；（4）最小和均勻圖像背景強度。第44頁圖象預處理網格定位背景濾除熒光信號提取歸一化處理第45頁網格定位結果第46頁背景區域背景濾除熒光信號提取第47頁２、檢測結果分析假如芯片檢測目標是測定樣本序列，則需要依據芯片上每個探針雜交結果判斷樣本中是否含有對應互補序列片段，并利用生物信息學中片段組裝算法連接各個片段，形成更長目標序列。第48頁假如芯片檢測目標是進行序列變異分析，則要依據全匹配探針以及錯配探針在基因芯片對應位置上熒光信號強度，給出序列改變位點，并指明發生什么改變。第49頁假如芯片檢測目標是進行基因表示分析，則需要給出芯片上各個基因表示圖譜，定量描述基因表示水平，深入分析還包含依據基因表示模式進行聚類，尋找基因之間相關性，發覺協同工作基因第50頁３、檢測結果可靠性分析可靠性分析能夠從兩個方面進行：一是依據試驗統計誤差（如探針合成錯誤率、全匹配探針與錯配探針誤識率等），計算出基因芯片最終試驗結果可靠性。二是對基因芯片與樣本序列雜交過程進行分子動力學研究，建立芯片雜交過程計算機仿真試驗模型，方便在制作芯片之前分析所設計芯片性能，預測芯片試驗結果可靠性。第51頁４、數據分析基因芯片數據分析包含試驗數據管理、數據質量控制、數據處理等深入將基因芯片試驗數據與公共數據庫中信息相關聯，利用數據挖掘方法進行分析處理，揭示各種數據之間關系，發覺新生物學知識。第52頁第六節基因芯片信息管理和利用１、芯片信息管理當前已出現一些芯片信息管理數據庫，這些數據庫主要搜集、管理表示型