第節2微生物的培養技術及應用高中生物選擇性必修3第1章簡述培養基的配方和微生物培養的基本操作要求，進行酵母菌的純培養。闡明微生物選擇培養的原理。進行土壤中分解尿素的細菌的分離和計數。學習目標微生物原核:真核非細胞類：細菌、放線菌、支原體、藍藻等酵母菌、霉菌等真菌：原生生物病毒、類病毒、朊病毒等①種類多；②分布廣；③易培養；④個體微小；⑤結構簡單；⑥繁殖快；⑦代謝強；⑧易變異。微生物的類群顯微藻類：衣藻、小球藻等原生動物：草履蟲、變形蟲等微生物的特性（一）球菌（二）桿菌（三）螺旋菌肺炎雙球菌金黃色葡萄球菌乳酸鏈球菌大腸桿菌蘇云金芽孢桿菌枯草芽孢桿菌霍亂弧菌幽門螺旋菌齒垢密螺旋體細菌的形態細菌的芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體（不是繁殖體），叫做芽孢。

芽孢的壁很厚，含水量極低，抗逆性極強（對干旱、低溫、高溫等惡劣的環境有很強的抵抗力）。細菌芽孢的結構模式圖環境適宜時，芽孢可以萌發，形成一個細菌。

菌落具有大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等基本特征。

菌落是鑒定菌種的重要依據。菌落

菌落由單個細菌（或其他微生物）細胞或少數同種細胞在適宜固體培養基表面或內部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見的子細胞群落。病毒的繁殖吸附注入合成釋放組裝

噬菌斑即噬菌體侵染細菌細胞，導致寄主細胞溶解死亡，因而在瓊脂培養基表面形成的肉眼可見的透明小圓斑（“負菌落”）。

在適當條件下，一個噬菌體形成一個噬菌斑。

一

微生物的基本培養技術1.接種工具：①接種針：直線狀，多用于固體培養基穿刺接種。②接種環：環狀，常用于細菌和酵母菌的斜面、平板接種。斜面平板接種針、鉤、環③接種鉤：直角狀，多用于霉菌和放線菌的接種。2.涂布器：多用于菌種的分離或微生物平板活菌計數時涂布。3.吸管：0.1、0.2、0.5、1、5、10mL等移液管，常用于液體接種及菌懸液系列稀釋。4.試管、培養皿、錐形瓶等5.消毒、滅菌設備：酒精燈、干熱滅菌箱、高壓蒸汽滅菌鍋等。6.無菌實驗室、超凈工作臺等二、基本成分（一）碳源①無機碳源：②有機碳源：CO2、HCO3-等，適于自養生物。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，適于異養生物。（二）氮源①無機氮源：②有機氮源：N2、NH4＋、NH3、NO3-等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等培養基

人們按照微生物對__________的不同需求，配制出供其

的營養基質叫培養基（三）無機鹽1.種類：KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。營養物質生長繁殖2.功能（1）參與酶的組成；（2）調節并維持細胞的滲透壓；（3）調節pH的平衡。（四）水（1）良好溶劑，參與物質運輸；（2）參與細胞內一系列化學反應；（3）酶催化的介質。

注一：最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖。注二：最常用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。注三：含C、H、O、N的有機物是異養型微生物的

碳源、氮源、能源注四：在提供幾種主要營養物質外，培養基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2

的需求。例如，在培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加維生素；在培養霉菌時，需要將培養基調至酸性；在培養細菌時，需要將培養基調至中性或弱堿性；在培養厭氧微生物時，需要提供無氧的條件。三、種類種類是否含凝固劑用途固體培養基半固體培養基液體培養基（一）按物理性質分1.5%-2.5%0.2%-0.7%否分離、計數、鑒定觀察運動、鑒定菌種工業生產固體培養基：菌落半固體培養基：運動液體培養基：生長（二）按化學成分種類化學成分用途天然培養基合成培養基不明確明確工業大規模生產分類、鑒定（三）按培養基的功能（用途）1.基礎培養基（1）成分：一般微生物生長繁殖所需要的基本物質（2）常用類型：牛肉膏蛋白胨培養基（20.0g瓊脂）種類制備方法原理用途舉例2.選擇培養基3.鑒別培養基加入相應特殊營養物質或化學物質加入某種特殊的化學物質依據某些微生物的特殊營養需求或對某些物質的敏感性依據微生物的代謝產物與特殊化學物質發生特定的反應，產生明顯的特征變化。從眾多微生物中分離所需的微生物鑒別不同種類微生物①加入青霉素分離酵母菌和霉菌②缺氮培養基分離固氮菌③高濃度食鹽的培養基分離金黃色葡萄球菌④無碳培養基分離自養型微生物①伊紅和美藍培養基鑒別大腸桿菌②剛果紅培養基鑒別纖維素分解菌一、含義

泛指在分離、接種和培養微生物的操作中，所有防止其他微生物污染的方法。是成功地培養微生物的關鍵。

無菌技術二、范圍1.對實驗操作空間、操作者衣著和手進行清潔和消毒。2.對培養器皿、接種用具、培養基等進行滅菌。3.在酒精燈旁操作4.已滅菌的材料與周圍的物品分開。三、消毒、滅菌（一）消毒：是指較為溫和物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。（不包括芽孢、孢子）1.巴氏消毒法

70℃～75℃煮30min或在85℃煮15min；殺滅非芽孢致病菌，不破壞物料原風味；適用于對牛奶、啤酒等消毒。

2.煮沸消毒法在100℃煮沸5～6min可以殺死微生物細胞和部分芽孢。

3.化學藥物消毒法①酒精消毒：使細胞脫水、蛋白質變性。

②氯氣消毒：氯氣溶于水形成鹽酸和次氯酸，次氯酸

可放出新生態的氧，從而殺死細胞。③其他：升汞、高錳酸鉀、臭氧、甲酚皂、醋酸等等。4.紫外線消毒法例如，接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強消毒效果。（二）滅菌：強烈的理化方法，殺死物體內外所有微生物（包括芽孢、孢子）1.濕熱滅菌這是一種利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進行滅菌的方法。其中高壓蒸汽滅菌的效果最好。實驗室常用的高壓蒸汽滅菌鍋（見左下圖）就是以水蒸氣為介質，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，維持15～30min來滅菌的。（二）滅菌：強烈的理化方法，殺死物體內外所有微生物（包括芽孢、孢子）將微生物的接種工具，如涂布器、接種環、接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速徹底地滅菌（見下圖）。此外，在接種過程中，試管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通過火焰灼燒來滅菌。3.灼燒滅菌討論:1．在高壓蒸汽滅菌開始以前，為什么要將滅菌鍋內的冷空氣排盡？

在高壓蒸汽滅菌以前，如果高壓蒸汽滅菌鍋內的冷空氣沒有排盡，當壓力上升到100kPa時，鍋內的溫度就不會上升到應有的高度，導致滅菌不徹底。2．滅菌完畢以后，如果壓力未降到0就打開排氣閥，會出現什么現象？為什么？

如果壓力未降到零就打開排氣閥，試管內的培養基就會沖出管口。這是因為高壓蒸汽滅菌鍋內外壓力不平衡的緣故。3．接種操作為什么一定要在火焰旁邊進行？

空氣中存在有大量的微生物，而接種燈的火焰旁能形成一個無菌區域，在這里操作，可以避免雜菌污染。一、培養物與純培養

在微生物在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養物。

由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得純培養物的過程就是純培養。微生物的純培養二、純培養的過程配置培養基→滅菌→接種→分離和培養三、酵母菌的純培養1.制備培養基（1）配置培養基稱取去皮的馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15～20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL。

（2）滅菌：將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15～30min。

將5～8套培養皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃滅菌2h。防止污染和揮發滅菌時避免水蒸氣浸濕棉塞，取出培養基時，也起到隔絕空氣中雜菌的作用（3）倒平板培養基冷卻至約50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板：②將瓶口迅速通過火焰，灼燒滅菌①左手拔出棉塞③用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基（10～20mL）倒入培養皿，立即蓋上皿蓋。④等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒過來放置。①加瓊脂的目的是什么?②在滅菌前,用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養基的錐形瓶的目的是什么？③培養皿能否用高壓蒸汽滅菌？作為凝固劑。在滅菌時能避免水蒸汽凝結時浸濕棉塞,在取出培養基錐形瓶時也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用不能,因為培養皿要保持干燥,應該用干熱滅菌.問題討論答：用手觸摸錐形瓶，感覺剛剛不燙手時。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。問題討論1.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：既可以防止培養基表面的水分過快揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，影響微生物的生長。4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？答：最好不要用。因為空氣中的微生物可能在此滋生。2.接種和分離酵母菌通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。經數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。平板劃線的具體操作見下面的流程圖：3.培養酵母菌通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。經數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。平板劃線的具體操作見下面的流程圖：問題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？①操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物②殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。③及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。

2.在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環溫度太高，殺死菌種。問題討論3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。4.平板劃線時不能劃破培養基的原因？二

微生物的選擇培養和計數1.選擇培養基（1）概念：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。（2）選擇培養基的設計選擇培養基配方的設計尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質相對穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，NH3

再轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源。討論如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？提示：培養基的配方中應含有微生物生長所需的營養要素——碳源、氮源、水、無機鹽等。由于絕大多數微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的細菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作為碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培養基中加入尿素提供氮源，使培養基具有了選擇作用。該培養基以尿素作為唯一氮源，只允許能以尿素作為氮源的微生物生長。討論2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？該培養基與普通培養基相比較，共同點是都以有機碳（如葡萄糖）作為碳源，都有水和無機鹽；不同點是該培養基以尿素作為唯一氮源，使只有能以尿素作為氮源的微生物生長。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106（1）梯度稀釋菌液：菌液微量移液器2.微生物的選擇培養浸不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍（2）涂布平板：（1）梯度稀釋菌液：2.微生物的選擇培養稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍（2）涂布平板：（1）梯度稀釋菌液：2.微生物的選擇培養1.涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第（2）步應如何進行無菌操作？

應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。問題討論2.培養基的制作是否合格？

如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。3.接種操作是否符合無菌要求？

如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。例、平板劃線法和稀釋涂布平板法接種大腸桿菌的操作中，相同的是（）

①可以用相同的培養基

②都需要使用接種針進行接種③菌液均需稀釋后再接種④都可以用來計數活菌⑤依據的原理相同⑥都需要在火焰旁進行接種A．①②B．③④

C．①⑥D．②④C（1）顯微鏡直接計數：可以利用血球計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察缺點3.微生物的數量測定（2）間接計數法（活菌計數法）①常用方法：

當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。②原理：稀釋涂布平板法思考：活菌計數法統計的菌落數是否與活菌實際數目吻合？為什么？統計的菌落數往往比活菌的實際數目低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只有一個菌落因此，統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。

例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果。1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230。

2、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統計結果。

你認為這兩位同學的做法正確嗎？如果有問題，錯在哪？甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板）乙：A組結果誤差過大，不應用于計算平均值注：誤差太大，須重做或再多設幾組?注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30—300的平板上進行計數。②為使結果接近真實值將同一稀釋度至少涂布三個平板作重復組，培養計算出菌落平均數。③統計的菌落往往比活菌的實際數目低，因此，統計結果一般用菌落數來表示。⑤每克樣品中的菌株數＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。利用選擇培養基進行尿素分解菌的分離過程中，從對應稀釋倍數為106的培養基中，A、B兩同學分別得到以下兩種統計結果。1、A同學篩選出150個菌落。

2、B同學篩選出50個菌落。B認為A的培養基被雜菌污染了，或培養基中混入了其他含氮物質，因而導致不能分解尿素的細菌也能在該培養基中生長。A確認自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據。

?原因：⑴土樣不同⑵培養基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照組的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養，作為空白對照，以證明培養基是否受到污染。結果預測：a.如果結果與A同學一致，則證明A無誤；b.如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養基的配制有問題。一、提出問題土壤中含有能分解尿素的細菌，我們如何分離它們？每克土壤樣品究竟含有多少這樣的細菌？土壤中分解尿素的細菌的分離與計數二、使用的培養基：1.從物理性質看此培養基屬于哪類？固體培養基2.該培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？③此培養基能否篩選出產生脲酶的細菌？為什么？碳源：葡萄糖氮源：尿素能。該培養基的唯一氮源為尿素，只有產生脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源而生存。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4H2O定容至1000mL三、實驗設計㈠.土壤取樣細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數分布在距地表3～8cm的土壤層。在城市，常見的是公園里、街道旁、花盆中的土壤；在農村，則容易收集到農田或菜園里的土壤。你打算選擇什么樣的土壤做實驗呢？◆取樣要求：先鏟去表層土，再取樣?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）樣品的稀釋測定土壤中細菌的數量，一般選用1×104、1×105

和1×106倍稀釋的稀釋液進行平板培養。測定土壤中細菌的總量和能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？如果不同，你打算選用多大的稀釋范圍？當你第一次做這個實驗的時候，可以將稀釋的范圍放寬一點。例如，可以將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數為30～300的平板進行計數?！魬诨鹧媾苑Q取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行。◆在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養。以保證獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板。

細菌稀釋度為104、105、106放線菌稀釋度為103、104、105真菌稀釋度為102、103、104為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？原因：土壤中各類微生物的數量是不同的。結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。（三）微生物的培養與觀察不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養1～2d。本實驗中，我們可以每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。在菌落計數時，每隔24h統計一次菌落數目。選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間：細菌：30～37℃培養1～2d放線菌：25～28℃培養5～7d霉菌：25～28℃培養3～4d一般來說，在一定的培養條件下（相同的培養基、溫度及培養時間），同種我微生物表現出穩定的菌落特征。包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面。菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據。（四）操作提示

1.將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。2.要按照前面學習過的無菌操作的方法，進行規范