布魯氏菌病檢疫技術規范7.2細菌培養細菌培養方法按GB/T18646執行。7.3多重聚合酶鏈式反應(多重PCR)7.3.1儀器和設備高速低溫離心機、手掌式臺式離心機、PCR擴增儀、水平電泳儀、凝膠成像分析儀、水浴鍋、漩渦振蕩器、可調移液器。73.2試劑和材料7.3.2.1細菌基因組DNA提取試劑盒。7.3.2.2布魯氏菌質控菌株：豬種布魯氏菌標準菌株或其模板DNA。7.3.2.310×Taqbuffer,dNTP混合液(2.5mmol/L,含鎂離子)、TaqHS聚合商(250U,5U/μL)或其他適合的商品化的PCR試劑，5kbDNA分子質量標準(5kbDNAmarker)7.3.2.4TE緩沖液、1X電泳緩沖液(1XTBE)、GelRed或其他適合的商品化的安全無毒核酸凝膠染色試劑、10×加樣緩沖液或其他適合的商品化加樣緩沖液，按附錄C配制。7.3.2.5瓊脂糖。7.3.2.6試驗用雙燕水(ddH?O):符合GB/T6682中的二級水。7.3.2.7移液器滴頭：10μL、200μL、1000pL。7.3.2.8PCR反應管。73.3操作步驟7.3.3.1樣品制備7.3.3.1.1標準菌株：用無菌接種環挑取單個布魯氏菌質控菌株菌落，放入200μL無菌雙蒸水。7.3.3.1.2樣品：可疑布魯氏菌培養物，用接種環挑取單個可疑菌落于200μL無菌雙蒸水。7.3.3.2DNA模板的提取將7.3,3.1制備的菌懸液80℃滅活2h,按適合的基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取模板DNA,然后12000v/min離心20s,取上清液作為PCR擴增時模板DNA(DNA濃度為0.1μg/μL~PCR引物序列見表1。表1PCR引物序列ATC-CTA-TTG-COC-CGA-TAA-GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT2GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATCGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CT序列5'→3TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAGCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TG4TOG-TCG-GTG-GAC-TGG-AT5GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACAAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-6GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTGAT-GGA-GCA-AAC-GCT-G7CAG-GCA-AAC-CCT-CAG-GAT-GTG-GTA-ACGCAC-AC8CGC-AGACAG-TGA-CCA-GTA-TTC-AGC-COC-CGT-TA9AGA-TAC-TGG-AAC-ATA-GCC-ATA-CTC-AGG-CAG-GAT-ACC-擴增牛種布魯氏菌疫苗株RBS1時片段大小為252.5mmol/L.dNTP溫合液(含接高子)TaqDNA聚合南(5U/μL)體系中。+一+++一+5+一十一十+十一十6十一十十十十一十7++十+++65表3結果判定(續) 5 5 ++ + 左 7.4.1.2.1細菌基因組DNA提取試劑盒或組織和全血基因組DNA提取試劑盒或用于奶樣基因組DNA提取試劑盒。將7.3.3.1制備的菌懸液或增菌液或陰道分泌物、全血、奶液、子宮或脾組織均質液等檢疫樣品80℃滅活2h,按適合的基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取DNA,12000r/min離心20s,取上上游引物(IS117-F1);5'-CGCTCGCGCGGTG注：菌是液樣品提取的模板DNA用量1.0L+檢疫樣品提取的模板DNA用量9引物序列S'→探針序列S'→'1FAM-CCTCGOCATGGC0OCCAA-B2FAM-TGGAACGACCTTTGCAGG3FAM-ATATGGOCGGCTATCOGOGT4FAM-TGGCCTGACGGACGCGCT5FAM-CCAOGGCTTTCGCTCCGGC-注，菌懸液樣品提取的模板DNA用量1.0mL:檢疫樣品提取的模板DNA用量9直的偏振光強度來確定。因而，大分子比轉動快的小分子發射更多的偏振光。當樣品中有目標抗體8.6.4.2將25×濃縮反應緩沖液用燕餾水做1:25稀釋，制備稀釋的反應緩沖液避免有顆粒物，稀釋8.6.4.6取20mL.血清樣品加人微量板其8.6.4.8將反應板置室溫(18℃~26℃)孵育3min~5min后，置熒光偏振儀(激發波長485nm,發射8.6.4.10將反應板置室溫(18℃~26℃)孵育2min~3min,置熒光偏振儀上讀取最終偏振值。當陽性對照的偏振值為120mP~250mP,陰性對照的偏振值為70mP~95mP時，方可進行被檢樣品的結果判定。若陽性對照或陰性對照的偏振值超出規定的范圍，需要根據儀器手冊的說明重新校結果判定計算見式(2)。△——樣品的偏振值與陰性對照平均偏振值的差值，單位為毫偏振(mP);可疑樣品應雙份重復試驗。若兩次樣品的△均小于10mP,判為陰性；若有一次樣品的△在可疑值范圍內或大于陽性值范圍，判為可疑，應采用其他試驗進行確證：若兩次樣品的△均大調pH至8.3±0.02,最后補加蒸餾水至2000mL。分別取瓊脂糖1g、氯化鈉10g、硼酸鹽緩沖液100mL卻至56℃左右，將平皿置于水平臺上，在每個平皿中加入約15mL(厚約2.5mm),凝固后加蓋，把平皿倒置，于4℃冷藏保存備用。反應孔現用現打，從冰箱中取出制備好的瓊脂平板，待平板恢復至室溫(20℃~25℃)后，用打孔器打孔，將孔中的瓊脂柱用針頭輕輕挑出或用真空泵吸管吸出，勿傷邊緣。每個平板可打5組~用可調移液器加樣，見圖1加樣。"G"孔加抗原，"+"孔加陽性對照血清，其他孔均加被檢血清。每孔均以加滿而不溢出為度。然后將瓊脂板放入有濕紗布的帶蓋的涅盒內，置室溫中感作。8.7.3.4.1于24h初判，48h終判，判定時借助觀察燈或自然光源。8.7.3.4.2當陽性對照血清孔與抗原孔間形成一條清晰、致密沉淀線時，本試驗成立，否則需要重新做試驗。8.7.3.4.3如果被檢血清孔與抗原孔間形成沉淀線，且與陽性對照血清孔和抗原孔間形成的沉淀線末端相融合，則判為陽性(見圖2)。魚◎◎◎田8.7.3.4.4如果被檢血清孔與抗原孔間無沉淀線形成，但陽性對照血清孔與抗原孔間形成的沉淀線末端在被檢血清孔與抗原孔間向抗原孔側彎曲，則判為弱陽性，應重復試驗，仍為弱陽性者判為陽性(見++O◎④(規范性)10mL.1mol/LTris(pH8.0),2mL0.5mol/L.Na?EDTA(pH8.0),加水定容至1000