1GB/T××××—202×化學品體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗方法本文件規定了化學品體外哺乳動物細胞試驗方法的范圍、術語和定義、試驗基本原則、試驗方法、試驗數據和報告。本文件適用于化學品體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗。2規范性引文本文件沒有規范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1術語和定義3.1.1非整倍體aneuploidy正常二倍體（或單倍體）染色體數目中缺少或增加一條或多條，但不是整套染色體（多倍體）的增減。3.1.2染色單體斷裂chromatidbreak染色單體的不連續，其中有一條明顯的不對稱染色單體。3.1.3染色單體裂隙chromatidgap單個染色單體上出現的無染色質的區域，其寬度小于染色單體的橫截面的寬度。3.1.4染色單體型畸變chromatid-typeaberration表現為染色單體斷裂或染色單體間斷裂和重接的染色體結構損傷。3.1.5染色體型畸變chromosome-typeaberration表現為兩條染色單體在相同位點的斷裂或斷裂重接的染色體結構損傷。3.1.6染色體斷裂劑clastogen任何能引起細胞或真核生物染色體結構畸變的物質。3.1.72GB/T××××—202×內復制endoreduplicationDNA復制的S期末，細胞核沒有進入有絲分裂，而開始另一個S期的過程，其結果是染色體具有3.1.8基因毒性genotoxic一個包含所有類型的DNA或染色體損傷的總稱，包括斷裂、缺失、加合、核苷酸修飾和連接、重排、基因突變、染色體畸變和非整倍體。并不是所有類型的基因毒性效應都會導致突變或穩定的染色體損傷。3.1.9有絲分裂指數mitoticindex有絲分裂的細胞數量與總細胞數量之比，用來衡量增殖狀態細胞數量的指標。3.1.10數目畸變numericalaberration染色體數目的改變，不同于所用細胞的正常染色體數目。3.1.11多倍體polyploidy單倍體染色體（n）數目的倍數，但不包括二倍體（即3n，4n等）。3.1.12相對細胞增長數relativeincreaseincellcounts，RICC與試驗樣品接觸培養的細胞數目的增加與未處理培養物細胞數日增加的比值，以“%”表示。3.1.13相對群體倍增數relativepopulationdoubling，RPD與試驗樣品接觸培養的細胞倍增數與未處理培養物的細胞倍增數的比值，以“%”表示。3.1.14結構畸變structureaberration顯微鏡下觀察到的細胞分裂中期的染色體結構的改變，例如缺失、斷裂、內交換或者相互交換。4試驗基本原則除非使用的細胞具有足夠的代謝能力，否則人類或其他哺乳動物來源的細胞需要暴露在有或無外源性代謝激活源的試驗化學品中。通常將培養細胞與受試物接觸一定的時間后，再用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）進行處理，通過對處于有絲分裂中期的哺乳動物細胞的染色體畸變情況進行分析，評價試驗樣品潛在的致畸變性。5試驗方法5.1準備5.1.1細胞3GB/T××××—202×可選用的細胞包括中國倉鼠卵巢細胞（CHO中國倉鼠肺細胞V79，中國倉鼠肺細胞（CHL）以及包括人或其他哺乳動物的外周血淋巴細胞在內原代細胞。當使用原代細胞時，在可行的情況下宜考慮使用來自人類的原代細胞，并根據人類倫理原則和規定進行抽樣。人外周血淋巴細胞宜來自年輕（約18歲-35歲）、無吸煙史、無已知疾病且最近未接觸遺傳毒性物質（如化學試劑、電離輻射）的獻血者以確保染色體畸變的背景發生率低且一致。5.2培養基及培養條件宜使用合適的培養液和培養條件（培養容器、濕化的5%CO2，培養溫度37℃)來維持所培養細胞的生長。需要定期檢查細胞系模態染色體數目的穩定性和支原體污染情況，否則不宜使用。細胞應置于液氫中冷凍保存。實驗室宜測定細胞系或原代細胞的正常細胞周期時間，并與公開發表的細胞特征一致。5.3培養物準備5.3.1細胞系：細胞傳代時，以一定密度接種在培養基中，以使懸浮液或單層細胞在收獲時間之前繼續呈指數增長（例如，單層細胞生長應避免匯合）。5.3.2淋巴細胞：用抗凝劑（例如肝素）處理過的全血或分離的淋巴細胞在有絲分裂原（例如用于人類淋巴細胞的植物血凝素（PHA）下培養，以便在暴露于測試化學品之前誘導細胞分裂。5.4代謝活化在加入或者不加入代謝活化系統的條件下，細胞暴露于受試物。當細胞內源性代謝能力不足時，應使用外源性代謝系統。最常用的活化系統是經酶誘導劑處理的，如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘酚黃酮的聯合誘導后的嚙齒動物（通常是大鼠）的肝臟中制備的加有輔助因子的后線粒體組分（S9）。S9濃度通常為1~2%（v/v但可能在最后的試驗培養基中最大增加到10%（v/v）。S9的使用可以減少細胞有絲分裂的指數，接觸期間宜避免使用鈣絡合產品。外源性代謝激活系統或代謝誘導劑的類型和濃度的選擇可能會受到所測試物質的類別的影響。5.5受試物的準備固體試驗化學品應在適當的溶劑中制備，并在細胞處理前進行適當稀釋。液體測試化學品可直接添加到測試系統中，或在處理測試系統之前進行稀釋。對于氣體或易揮發性試驗化學品可以對標準規程進行適當修改后再進行測試，例如在密封培養容器中進處理。除非有資料證實儲存受試物是穩定的，否則應使用新鮮制備的受試物。5.6試驗條件5.6.1溶劑溶劑的選擇應在不影響試驗進行的情況下優化試驗物質的溶解度，例如改變細胞生長，影響試驗化學物質的完整性，與培養容器發生反應，損害代謝激活系統等。在可行的情況下，首先考慮使用水溶液溶劑（或培養基）。目前公認的溶劑如水或二甲亞砜。通常，在最終接觸濃度中有機溶劑濃度不得超過1%（v/v水溶劑（鹽水或水）不得超過10%（v/v）。如果使用的溶劑沒有確定的標準（例如乙醇或丙酮則使用時應有數據支持，表明其與試驗化學品的相容性、試驗系統以及所使用的濃度下其沒有遺傳毒性。如果缺乏支持性的數據，那么重要的是納入未經處理的對照組，以證明所選溶劑不會產生有害或造成染色體斷裂的作用。5.6.2染毒劑量的選擇5.6.2.1在正式試驗中，應使用適當的細胞死亡和生長指標來確定受試物有無代謝激活的細胞毒性。4GB/T××××—202×5.6.2.2相對群體倍增數（RPD）或者相對細胞增長數（RICC）是細胞遺傳學試驗中評估細胞毒性的常用方法。在長期接觸的情況下，如果開始接觸樣品后的采樣時間超過1.5個正常細胞周期，則RPD可能會低估細胞毒性大小，而在這種情況下選擇用RICC或重新用RPD在1.5個正常細胞周期內進行評估。5.6.2.3當確定試驗所需的最高劑量濃度時，應當考慮由于對細胞產生高毒性，能在培養基中產生沉淀，或者由于pH和滲透壓的顯著改變而引起的假陽性。如果加入試驗樣品使培養液的pH發生明顯的變化，則可以調節最終處理培養液的pH，以避免產生假陽性結果。5.6.2.4應評估至少三個滿足可接受標準（適當的細胞毒性、細胞數量等）的測試濃度（不包括溶劑和陽性對照）。無論細胞類型是什么（細胞系或淋巴細胞的原代培養物在每個測試濃度下都可以進行單一或平行培養物的處理。對于顯示很少或沒有細胞毒性的試驗化學品，大約2至3倍的濃度間隔通常是合適的。在發生細胞毒性的情況下，選擇的測試濃度應涵蓋產生細胞毒性的濃度范圍，包括中度和極少或沒有細胞毒性的濃度。許多受試物表現出陡峭的濃度響應曲線，為了獲得低和中等細胞毒性的數據或詳細研究劑量響應關系，有必要使用更緊密的濃度和/或三個以上的濃度，特別是需要對實驗進行重復的情況下。5.6.2.5如果最大濃度的選擇是基于細胞毒性，推薦細胞毒性參數實現55±5%的細胞毒性作為最高濃度進行使用（即細胞系的RICC和RPD降低，淋巴細胞的有絲分裂指數降低至陰性對照的45±5%但是在解釋僅在55±5%細胞毒性范圍內發現陽性結果時應小心。5.6.2.6對于難溶解的受試物，如果在低于最低溶解度時仍然沒有細胞毒性，那么所使用的最高濃度應在受試物處理結束時產生渾濁或肉眼或倒置顯微鏡可見的沉淀物。即使細胞毒性在最低溶解度以上的濃度發生，建議只在產生渾濁度或有可見沉淀物的濃度下進行測試，因為沉淀物可能會產生假陽性。在使用產生沉淀的濃度時，應小心確保沉淀不會干擾試驗的進行(例如染色或評分)。因此，推薦在試驗前測定培養基中的溶解度。5.6.2.7如果沒有觀察到沉淀或細胞毒性，則最高測試濃度應對應于10mM、2mg/mL或2μl/mL，以最低者為準。當測試化學品的成分不確定時，例如成分未知或可變的物質、復雜反應產物或生物材料（即UVCBs）等環境提取物等，在沒有足夠的細胞毒性的情況下，可能需要提高處理濃度（如5mg/ml或者增加每種成分的濃度。但應該注意的是，這些要求對人類用藥可能有所不同。5.6.3對照5.6.3.1每個試驗均應在加入和不加入代謝活化系統的條件下，設置平行的陰性（溶劑）和陽性對照。在使用活化代謝系統時，陽性對照物應是需要經代謝活化過程才顯示突變作用的化學物。5.6.3.2陽性對照應使用已知的斷裂劑，其染毒水平應該有明顯超過本底值的且可重復陽性結果，以證明實驗室在所用測試方案的條件下具有檢測染色體斷裂的能力并確定代謝活化系統的有效性。陽性對照的濃度應合理設置，最好是效果既明顯又不會讓閱片者立即發現其為陽性對照的標本片。下面的表1給出了一些陽性對照的例子。表1推薦陽性對照選擇的參比物質表1推薦陽性對照選擇的參比物質（續）5GB/T××××—202×5.6.3.3也可使用其他合適的陽性對照物，如果有可能，可利用與受試物化學結構相關的陽性對照物。5.6.3.4每個收樣時間都應該包括同期陰性對照，指的是培養液中僅含有溶劑，不含有受試物，并與處理組相同的方法處置的培養物。5.7試驗步驟5.7.1染毒在加入或者不加入代謝活化系統的條件下，給處在增殖期的細胞染毒受試物，淋巴細胞應該在刺激有絲分裂后約48小時后開始染毒。5.7.2收樣時間在首次試驗時，細胞應該在加入或者不加入代謝活化系統條件下染毒3h至6h，并在開始染毒后約1.5個正常細胞周期時收樣。如在加入和不加入代謝活化系統的條件下均為陰性結果，則應再進行一次不加入代謝活化系統的實驗，并延長染毒時間至1.5個正常細胞周期時收樣。一些化學品在染毒或者收樣時間長于1.5個正常細胞周期時更容易檢測。5.7.3染色體標本的制備在收樣前1-3h加入秋水仙素或秋水仙堿，收集每個細胞培養物并分別制備染色體。染色體的制備包括細胞的低滲處理、固定和染色。在單層細胞中，有絲分裂細胞（可識別為圓形并從表面分離）可能在3-6h處理結束時出現。這些有絲分裂細胞很容易被分離，所以當含有測試化學物質的培養基被去除時，它們就會丟失。如果有證據表明有絲分裂細胞的數量與對照相比有大幅度增加，表明有絲分裂可能被阻滯，那么應該通過離心收集細胞并加入培養物中，以避免在收獲時丟失處于有絲分裂狀態且有染色體畸變風險的細胞。5.7.4染色體分析5.7.4.1包括陰性和陽性對照在內的所有涂片，均應在進行染色體畸變顯微鏡分析之前獨立編號。由于固定過程可導致一定數量的中期分裂細胞破損而丟失染色體，因此，其數目應等于各類細胞模式數目的2n±2（modelnumber±2每個濃度組和對照組至少計數300個分布良好的中間分裂相細胞。當有平行皿的培養物涂片時，300個細胞應該在復制中平均分配。當觀察到大量的染色體畸變細胞時，可以適當減少中期分裂相細胞數目。5.7.4.2應單獨記錄染色單體和染色體畸變類型，并按照亞型進行分類（斷裂或者交換以及記錄出現的多倍體和內含子重復頻率。實驗室操作流程應確保由訓練有素的評分員進行染色體畸變分型，并根據情況進行過同行監督審查。6試驗數據和報告6GB/T××××—202×6.1數據處理6.1.1由于試驗對象是細胞，因此應評價有染色體畸變的細胞的百分率，應列出染毒組和對照組不同亞型（斷裂或交換）染色體結構畸變的數目和頻率。可報告染色單體裂隙但是不計入總畸變頻率中。報告中還應包含發現的多倍體及核內復制的頻率。6.1.2應記錄整個實驗過程中所有測定的染毒組和對照組的細胞毒性的結果。6.1.3應提供各個培養物的資料，且所有資料以表格形式列出。6.2結果評價6.2.1陽性結果的判斷標準：與同期陰性對照相比，至少一種試驗濃度在統計學上顯著增加；如有多組劑量試驗時，染色體畸變細胞數的增加與濃度相關或含染色體畸變的細胞數的增加是可重復的；任何一個處理組超出了歷史陰性對照數據的分布范圍（如95%的控制限值）。此外，應首先考慮結果的生物學意義，可利用統計學方法幫助評價試驗結果，但統計學顯著性不應該是確定陽性結果的唯一標準。6.2.2結果不符合上述標準的受試物可認為在本系統中無誘發染色體畸變的作用。6.2.3如果反應不是上述描述中明確的陽性或者陰性結果，為了進一步驗證，應通過專家判斷或者進一步重復試驗來評估，也可增加鏡檢細胞數目或改進試驗條件（例如濃度間隔，其他代謝活化條件）進行重復試驗。在極少數的情況下，如果進一步試驗以后，仍然無法得出陽性或者陰性的結果，則改受試物的結果被認為是不確切的或可疑的。6.2.4體細胞數目的增加可能表明，受試物可能具有潛在的抑制有絲分裂的過程，并誘發染色圖數目畸變。核內復制染色體的細胞數量增加可能表明，受試物具有抑制細胞周期進展的作用。6.2.5體外染色體畸變試驗陽性結果表明，受試物可誘發體外培養的哺乳動物體細胞染色體結構畸變。陰性結果則表明，在本實驗條件下受試物不具有誘發體外培養的哺乳動物體細胞染色體結構畸變的作用。6.3試驗報告試驗報告應包括下列內容：a)受試物——名稱、規格型號和批號及有效期（如已知——穩定性（如已知——受試物在溶劑中的溶解度及穩定性（如已知——受試物在培養液中的PH、滲透壓以及沉淀（如已知——受試物是單組分物質時，需提供物理性質、水溶性和其他理化性質及化學鑒定，如IUPAC或CAS名稱、CAS編號、SMILES或InChI代碼、結構式、純度、雜質的化學鑒定等；——受試物為多組分物質、UVB及混合物時，需提供上述的化學性質以外，還需提供各成分的定量及相關的化學性質。b)溶劑——溶劑選擇的依據；——在最終細胞培養液中占比。c)細胞——細胞的類型及來源；——核型特征及細胞類型的適用性；——無支原體污染；——細胞周期長度、倍增時間及增殖指數；7GB/T××××—202×——供血者的性別、年齡和相關信息，全血或分離的淋巴細胞，有絲分裂源的使用；——細胞培養的代數；——細胞培養的方法；——模式（model）染色體的數目。d)試驗條件——中期分裂相阻斷劑名稱、濃度和細胞處理時間；——受試物在培養基中的最終濃度；——濃度選擇的依據及試驗的平行數，細胞毒性資料（如有——細胞培養液的組成，CO2體積分數（適用時）和濕度水平；——培養基中添加的溶劑和受試物的濃度或體積；——培養溫度；——培養時間；——染毒時間；——收樣時間；——染毒時細胞的密度（適用時——代謝活化系統的類型和組成（S9的來源，S9混合物的制備方法、S9混合物以及在最終培養液的濃度或體積；S9的質量控制，適用時——陽性對照和陰性對照的濃度；——涂片的制備方法和染色方法；——染色體畸變計數的標準；——結果偏差的標準；——被分析為細胞分裂中期的數量；——細胞毒性的測試方法；——陽性、陰性及可疑結果的判斷標準；——測定pH、滲透壓和沉淀的方法。e)結果——當使用細胞系時，處理時的細胞數量及每次收樣時的細胞數量；——細胞毒性的測定結果；——細胞周期長度、倍增時間及增殖指數的信息；——出現沉淀的方法及時間；——細胞畸變的類型，包括裂隙；——試驗組和對照組中計數的細胞數量、染色體畸變的細胞數量含或不含裂隙的細胞類型；——細胞倍性的變化（多倍體細胞和核內復制的細胞——劑量-反應關系（如可能——陰性和陽性對照的信息；——歷史陰性和陽性資料，包括分布范圍、平均值和標準差、95%控制限值；——統計方法以及P值。6.4結果的討論6.5結論8GB/T××××—202×（資料性）細胞毒性評