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DB 2305雙 鴨 山 市 地 方 標 準DB2305/T020—2024牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測規程2024-08-202024-08-202024-09-20雙鴨山市市場監督管理局發布DB2305/T020—2024DB2305/T020—2024目 次前 言 Ⅱ范圍 1規范性引用文件 1術語和定義 1縮略語 1主要儀器設備 1試劑 2樣品的采集與處理 3樣品采集 3樣品處理 3樣品病毒核酸RNA提取 3PCR擴增 3引物 3反應條件 4結果判定 4檢測結果成立條件 4結果判定 4實驗室無害化處理 4病料的無害化處理 4實驗室廢棄物處理 4實驗室分區 4實驗室生物安全管理 4前 言GB/T1.1-20201部分:標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由雙鴨市農業農村局提出并歸口。本文件起草單位：雙鴨市農業技術綜合服務中心、雙鴨山市基本建設項目服務中心、黑龍江農業職業技術學院。本文件主要起草人：王宇婷、白鷺、劉云、張紅軍、杜航、張榮翔、秦藕菊。III牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測規程范圍本文件規定了牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測方法的主要儀器設備、試劑、樣品采集與處理、樣品病毒核酸RNA提取，PCR擴增、結果判定、實驗室無害化處理等技術要求。本文件適用于牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。本文件沒有需要界定的術語和定義?？s略語BVDV：牛病毒性腹瀉病毒PCR：聚合酶鏈式反應RNA：核糖核酸cDNARNADNAPBS：磷酸鹽緩沖液EP管：微量離心管DEPC：焦碳酸乙二酯EDTA：乙二胺四乙酸PrimeSTARBuffer：聚合酶的緩沖液dNTPMix：脫氧核糖核苷三磷酸混合液DNAPolymerasePCRDNAddHO主要儀器設備二級生物安全柜412000r/min冰箱：2～8℃、-2070單道（或多道）微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）PCR1渦旋振蕩器電泳儀水平電泳槽凝膠成像系統全自動高壓滅菌鍋0.001g通風櫥pH試劑GB/T6682三級水要求。所用液體試劑均需使用RNA酶的容器進行分裝。TRIzol、氯仿、異丙醇（-20℃），均為商品化試劑。無水乙醇，應于-20℃預冷。DNAMarkerDL2000。75%75mL25mL0.1%DEPC水，應于-20℃預冷。0.1%DEPC0.1gDEPC100mL12h，121℃30min,冷卻后冷藏備用，在通風櫥中配制。30%30mL，氯化鈉（Nacl）4.2g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）3.1g，0.02%1.5mL100mLPh7.6，121℃高15min，4℃保存備用。50×TAE242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O800mL三級水中，充分攪拌混勻，加入57.1mL的冰乙酸，充分混勻，加三級水定容至1L，室溫保存。1×TAE20mL50×TAE1L，室溫保存。cDNA合成：反轉錄試劑盒。10mg/mL的溴化乙錠溶液：100mL1g，置棕色容器中攪拌數小時以確保完全溶解，用鋁箔包裹容器，保存于室溫。0.01mol/mLPBS：氯化鈉（Nacl）8g、氯化鉀（Kcl）0.2g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）2.9g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g1000mL。1%1g瓊脂糖于100mL1×TAE緩沖液中，加熱融化后充分搖勻，待冷至50℃～60℃，加入溴化乙錠溶液5μL。搖勻，倒入插好梳子的電泳板上，凝固后取下梳子，備用。陽性對照：BVDVddH2O。2樣品的采集與處理樣品采集按照NY/T541的規定執行。病死牛無菌采集典型、明顯的病變組織部位；活體采集EDTA抗凝全血（5mL～10mL），采血后輕輕顛倒混勻；糞便、口鼻分泌物拭子等分別裝入滅菌的2mLEP管中（在管中加入30%甘油磷酸鹽緩沖液中），所有樣品均編號備用。樣品處理組織樣品1g1.5mLEP75%1mLPBS進行研磨，制備組織勻漿，12000r/min5min，取上清液用于核酸提取。抗凝血樣品直接用于核酸提取。糞便、口鼻拭子樣品將拭子樣品，充分振蕩后，室溫靜置5min～10min，取上清1mL加到1.5mLEP管中，12000r/min離心15min，取上清液用于核酸提取。RNA2mLEP200μL1mLTRIzol10min。200μLEP15s10min4℃、12000r/min15min。500μL1.5mLEP500μL異丙醇（-20℃預冷）1.5mLEP10min。4℃、12000r/min15min600μL75%乙醇（-20℃預冷）顛倒洗滌。4℃、12000r/min10min，輕輕倒去上清液。4000r/min30s3min。50μLDEPCRNA，4000r/min30s，-20℃保存備用，長期保存需-70℃冷凍。8.9cDNA按照試劑試劑盒說明書反轉錄，得到cDNA。PCR引物引物序列表見表1。3表1：引物序列表病毒名稱序列名稱序列（5’-3’）牛病毒性腹瀉病毒上游引物GCTAGCCATGCCCTTAGTAGG下游引物TCCATGTGCCATGTACAGC9.2反應條件95℃預變性5min；94℃變性3min30s；60℃延伸40s；72℃退火1min；30個循環，72℃終延伸10min；最后4℃保溫。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，預期擴增片段大小約為300bp。表2PCR反應液配方組分牛病毒性腹瀉病毒1個反應體系加入量（μL）cDNA15×PrimeSTARBuffer5dNTPmix2DNApolymerase0.25上游引物1下游引物1滅菌ddH2O14.75結果判定檢測結果成立條件陽性對照的PCR產物孔出現300bp大小特異性目的條帶，陰性對照PCR產物無目的條帶，則檢測結果成立；否則，結果不成立。如陰性和陽性對照不滿足以上條件，則實驗視為無效，需重新檢測。10.2結果判定10.2結果判定PCR300bp大小特異性目的條帶，判為