黃瓜綠斑駁花葉病毒透射電子顯微鏡TestmethodofCucumbergreenmottlemosaicvirus2017-10-14發布2018-09-01實施中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局GB/T34331—2017 I Ⅱ 1 1 26透射電子顯微鏡檢測步驟 47血清學和分子生物學驗證 4 4 附錄A(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒相關資料 附錄B(資料性附錄)常用試劑的配方 附錄C(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒電鏡照片 IⅡ124.2試劑和材料4.2.2四氧化鋨(結晶體)。4.2.3丙酮(分析純)4.2.8磷鎢酸(分析純)。4.2.9亞甲基藍。超薄切片機：相對濕度小于60%,溫度(20±5)℃,電源電壓穩定(220±22)V,滿足防震要求。透射電鏡：相對濕度小于60%溫度(20±5)℃,電源電壓穩定(220±22)V,具備儀器專用地線，接5.1.3人工接種CGMMV的鑒別寄主和繁殖寄主植物。5.2.1進出境植物檢疫的取樣按照SN/T2122—2015的規定執行。5.2.2田間作物取樣及試樣處理按照SN/T2964—2011的規定執行。35.4.2.1在培養皿內鋪上Para酸緩沖液(pH值7.2)配制的2%～3%(v/v)戊二醛固定液進行前固定，在4℃下固定2h。戊二醛固4鈾染色時間15min～30min,檸檬酸鉛染色時間5min～10min,干燥后待檢。染色液的配制參見附錄B。6.3推薦放大倍率范圍：4000倍～20000倍。6.4懸液病毒試樣的透射電鏡觀察：低倍率(4-000倍左右)下選擇負染色劑著色的電子密度較大斑點用CCD相機記錄并儲存(或者用電子底片進行拍照)CGMMV粒子的典型形態參見附錄C。6.5超薄切片試樣的透射電鏡觀察，電鏡低信率模式倍~1000倍)尋找切片，切換到正常放大模式觀察病變的細胞。逐步提高放大倍率，仔細觀察細胞超散或聚集分布在細胞質內，病毒聚集體中的病毒粒子呈整化。CGMMV感染的細胞圖像精確聚焦后用CCD相機記錄并儲存(或者用電子底片進行拍照)。CGMMV粒子在感病細胞超薄切片中的典型形態參見附錄C。8檢測結果發布b)試樣名稱；f)檢測結果和必要的說明；g)檢測人簽字；h)檢測報告負責人的簽字；i)檢測報告的頁碼；j)發布檢測報告的實驗室名稱和地址；5保存在4℃冰箱內，葉片和果實試樣應保存在-20℃以下冰箱或凍干保存三67蛋白。5'端和3'端分別含有一段非編碼區。A.7分類地位(摘譯自：國際病毒分類委員會ICTV第九次病毒分類報告，2012)科(Family):植物桿狀病毒科Virgaviridae屬(Genus):煙草花葉病毒屬Tobamovirus種(Species):曼陀羅木輕癥斑駁病毒Brugmansiamildmottlevirus(BMMV)黃瓜果實斑駁花葉病毒Cucumberfruitmottlemosaicvirus(CFMMV)黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV)雞蛋花花葉病毒Frangipanimosaicvirus(FrMV)皮爾斯堡木槿潛隱病毒HibiscuslatentFortPiercevirus(HLFPV)新加坡木槿潛隱病毒HibiscuslatentSingaporevirus(HLSV)日本黃瓜綠斑駁花葉病毒Kyurigreenmotlemosaicvirus(KGMMV)老布達辣椒病毒Obudapeppervirus(ObPV)齒瓣蘭環斑病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)甜椒輕癥斑駁病毒Paprikamildmottlevirus(PaMMV)辣椒輕癥斑駁病毒Peppermildmotlevirus(PMMoV)長葉車前草花葉病毒Ribgrassmosai薩蒙氏仙人掌病毒Sanmon.Opuntiaarus(SOV)扭果苣營花碎色病毒Streptocarpusflowerbreakoirus(SFBV)煙草潛隱病毒Tobacolatentuirus(TLV)煙草輕癥綠花葉病毒Pobadeomildgreenmosaictmrus(TMGMiv)煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)番茄花葉病毒Tomatomosaicuirus(ToMV)蕪菁脈明病毒Turnipvein-clearingvirus(TVCV)塊根落葵輕癥斑駁病毒UllucusmildmottlevirusCUMMV)山崳菜斑駁病毒Wasabimottlevirus(WMoV)油菜花葉病毒Youcaimosaicvirus(YoMV)小西葫蘆綠斑駁花葉病毒Zucchinigreenmott8或NaH?PO?·2H?O31.21gNa?HPO?·2H?O或Na?HPO?·12H?O4689取等量的0.2mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)與2%四氧化鋨貯存液混合，現配現環氧樹脂Spurr's低黏度包埋劑配制見表B.3。8888327B.3.2環氧樹脂Epon812包埋劑環氧樹脂Epon812包埋劑配制見表B.4。B.4染色液配方B.4.12%磷鎢酸負染色液稱取1.0g磷鎢酸，用50mL雙蒸餾水配制成2%(w/v)的水溶液，用1mol/LNaOH調6.7～6.8,過濾后4℃下保存備用。B.4.