中華人民共和國國家計量檢定規程液相色譜儀2014-02-14發布2014-08-14實施液相色譜儀檢定規程I 2引用文件 3概述 4計量性能要求 4.1輸液系統 4.2柱溫箱 4.3檢測器 4.4整機性能 5通用技術要求 5.1儀器外觀 5.2儀器電路系統 6計量器具控制 6.1檢定條件 6.2檢定項目和檢定方法 6.3檢定結果 6.4檢定周期 附錄A色譜柱性能測試 附錄B單色器濾光片的性能測試 附錄C不同溫度下流動相密度 附錄D檢定證書(內頁)格式 附錄E液相色譜儀檢定記錄格式 JJG705-2014ⅡJJG705—2014《液相色譜儀》的編寫是以JJF1001—2011《通用計量術語及定 熒光檢測器檢定用標準物質改為萘-甲醇溶液； 示差折光率檢測器檢定用標準物質改為甲醇中膽固醇溶液——整機定性重復性由原來的1.5%修改為1.0%; 1分離系統進分離系統進樣系統流動相流動相液相色譜儀檢定規程本規程適用于配有紫外-可見光檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器、示差折光率檢測器和蒸發光散射檢測器的液相色譜儀的首次檢定、后續檢定和使用中檢查，2引用文件JJG537—2006熒光分光光度計液相色譜儀(以下簡稱儀器)是由輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統等部分組成的分析儀器，圖1是其組成的方框圖。液相色譜儀根據樣品中各組分在色譜柱內固定相和流動相間分配或吸附等特性的差異，由流動相將樣品帶入色譜柱中進行分離，經檢測器檢測并通過數據處理系統記錄色譜圖，依據各組分的保留時間和響應值(峰面積或峰高)進行定性和定量分析。輸液系統廢液收集4計量性能要求4.1輸液系統4.1.1輸液管路接口緊密牢固，在規定的壓力范圍內無泄漏。4.1.2泵流量設定值誤差Ss和流量穩定性SR應符合表1的要求。4.1.3梯度最大允許誤差G。:±3%。2表1泵流量設定值誤差Ss和穩定性S的指標要求泵流量設定值/(mL/min)0.2～0.50.6～1.0大于1.0測量次數333流動相收集時間/min20～105泵流量設定值最大允許誤差Ss泵流量穩定性S。注：①最大流量的設定值可根據用戶使用情況而定②對特殊的、流量小的儀器，流量的設定可根據用戶使用情況選大、中、小三個流量，流動相的收集時間則根據情況適當縮短或延長。4.2.1柱溫箱溫度設定值最大允許誤差：±2℃。4.2.2柱溫箱溫度穩定性：不大于1℃/h.4.3檢測器儀器的檢測器的主要技術指標見表2。表2液相色譜儀檢測器的主要技術指標檢測器紫外-可見光檢測器二極管陣列檢測器熒光檢測器示差折光率檢測器蕃發光散射檢測器基線噪聲①基線漂移最小檢測濃度蒸-甲醇溶液萘-甲醇溶液膽固醇-甲醇溶液膽固醇-甲醇溶液波長示值最大允許誤差———波長重復性———線性范圍優于103優于103優于103注：①若儀器的輸出信號用mV或V表示，注意查看儀器說明書或儀器標牌標明的其與AU(FU)的換算關系；若無特殊標明通常可按照1V=1AU(FU)進行換算，儀器的整機性能用定性定量測量重復性表示，指標要求見表3檢測器紫外-可見光檢測器二極管陣列檢測器熒光檢測器示差折光率檢測器蒸發光散射檢測器定性重復性定量重復性35通用技術要求5.1儀器外觀儀器上應有儀器名稱、型號、制造廠名、產品系列號、出廠日期等內容的標牌，國產儀器應有制造計量器具許可證標志。5.2儀器電路系統儀器電源線、信號線等插接緊密，各開關、旋鈕、按鍵等功能正常，指示燈靈敏，6計量器具控制計量器具控制包括：首次檢定、后續檢定和使用中檢查。6.1檢定條件6.1.1環境條件6.1.1.1檢定室應清潔無塵，無易燃、易爆和腐蝕性氣體，通風良好。6.1.1.2室溫(15～30)℃,檢定過程中溫度變化不超過3℃(對示差折光率檢測器，室溫變化不超過2℃),室內相對濕度20%～85%6.1.1.3儀器應平穩地放在工作臺上，周圍無強烈機械振動和電磁干擾源，儀器接地6.1.1.4電源電壓為(220±22)V,頻率為(50±0.5)Hz。6.1.2檢定設備6.1.2.1秒表：最小分度值不大于0.1s。6.1.2.2分析天平：最大稱量不小于100g,最小分度值不大于1mg。6.1.2.3數字溫度計：測量范圍為(0～100)℃,最大允許誤差為±0.3℃。萘-甲醇溶液標準物質：認定值為1.00×10-4g/mL,擴展不確定度小于4%,k=2;萘-甲醇溶液標準物質：認定值為1.00×10-7g/mL,擴展不確定度小于4%,k=2;甲醇中膽固醇溶液標準物質：認定值為200μg/mL,擴展不確定度小于甲醇中膽固醇溶液標準物質：認定值為5.0pg/mL,擴展不確定度小于5.0%,k=2;膽固醇純度標準物質：認定值為99.7%,擴展不確定度小于0.1%,k=2,6.1.4其他要求6.1.4.1檢定用試劑：色譜級甲醇，純水，分析純的丙酮和異丙醇，紫外分光光度計46.2檢定項目和檢定方法6.2.1檢定項目檢定項目見表4。表4檢定項目一覽表序號檢定項目首次檢定后續檢定使用中檢查1輸液系統：泵耐壓泵流量設定值誤差Ss泵流量穩定性SR梯度誤差G;②一①一①十一一十一2柱溫箱：溫度設定值誤差△T:-— 3檢測器：基線噪聲基線漂移最小檢測濃度波長示值誤差和重復性③線性范圍十十—4整機：定性、定量重復性十十十注：①“十”表示應檢定項目，“—”表示可不檢定項目：②無梯度洗脫裝置和無柱溫箱的儀器，此項不檢定；③紫外-可見光、二極管陣列和熒光檢測器檢定此項目，其他檢測器不檢定此項目，6.2.2檢定方法6.2.2.1通用技術要求按5.1和5.2的要求，目視、手動檢查。6.2.2.2輸液系統a)泵耐壓將儀器各部分連接好，以100%甲醇(或純水)為流動相，流量為0.2mL/min,按說明書啟動儀器，壓力平穩后保持10min,用濾紙檢查各管路接口處是否有濕跡。卸下色譜柱，堵住泵出口端(壓力傳感器以下),使壓力達到最大允許值的90%,保持b)泵流量設定值誤差Ss和流量穩定性Sp按表1的要求設定流量，啟動儀器，壓力穩定后，在流動相出口處用事先稱重過的潔凈容量瓶收集流動相，同時用秒表計時，收集表1規定時間流出的流動相，在分析天平上稱重，按公式(3)計算流量實測值F按公式(1)、公式(2)計算Ss和Sg。每一設定流量，重復測量3次。5Fm——同一設定流量3次測量值的算術平均值，mL/min;Fmx——同一設定流量3次測量值的最大值，mL/min;Fmin——同一設定流量3次測量值的最小值，mL/min。Fm=(W?-W?)/(p?·t)(3)F—流量實測值，mL/min;W?——容量瓶+流動相的質量，g;p.實驗溫度下流動相的密度，g/cm3,(不同溫度下流動相的密度參見附錄C);t-—收集流動相的時間，min。c)梯度誤差由梯度控制裝置設置階梯式的梯度洗脫程序(梯度程序可參照表5),A溶劑為純水，B溶劑為含0.1%丙酮的水溶液。將輸液泵和檢測器連接(不接色譜柱),開機后以A溶劑沖洗系統，基線平穩后開始執行梯度程序，畫出B溶劑經由5段階梯從0%變到100%的梯度變化曲線，如圖2所示。求出由B溶劑變化所產生的每一段階梯對應的響應信號值的變化值L;。重復測量2次，按公式(4)計算每一段階梯對應的響應信號值的變化平均值L;按公式(5)計算五段階梯響應信號值的總平均值工；;按公式(6)計算每一段的梯度誤差G;,取G;最大者作為儀器的梯度誤差。式中：L:第i段階梯響應信號值的平均值；Lu——第i段階梯第1組響應信號值；Liq-y——第(i-1)段階梯第1組響應信號值；Lz——第i段階梯第2組響應信號值；Lzq-1)——第(i-1)段階梯第2組響應信號值。元5段階梯響應信號值的總平均值；JJG705—20146輸出信號輸出信號G;——第i段階梯的梯度誤差。注：當i為1(i-1=0)時，第(i-1)階梯響應信號值為B溶劑為0%時的響應信號值。表5梯度程序設置序號A溶劑(純水)B溶劑(0.1%丙酮水溶液)12340%440%5670%A20%A40%A60%A80%A0%B圖2梯度誤差檢定示意圖6.2.2.3柱溫箱溫度設定值誤差△Ts和柱箱溫度穩定性TcJJG705—20147將數字溫度計探頭固定在柱溫箱內與色譜柱相同的部位，選擇35℃和45℃(也可根據用戶使用溫度設定)進行檢定。按儀器說明書操作，通電升溫，待溫度穩定后，記下溫度計讀數并開始計時，以后每隔10min記錄1次讀數，共計7次，求出平均值。平均值與設定值之差為柱溫箱溫度設定值誤差△Ts,7次讀數中最大值與最小值之差為柱溫箱溫度穩定性Tc。6.2.2.4紫外-可見光檢測器和二極管陣列檢測器的性能a)波長示值誤差和重復性將檢測器和數據處理系統連接好，通電預熱穩定后，用注射器將純水注入檢測池內進行沖洗后，充滿檢測池。待檢測器示值穩定后，在(235上5)nm、(257±5)nm、(313±5)nm和(350±5)nm的波長下將示值回零，然后再用注射器將紫外分光光度計溶液標準物質(參考波長為235nm,257nm,313nm和350nm)從檢測器入口注入樣品池中沖洗，并將樣品池充滿至示值穩定。將檢測器波長調到低于參考波長5nm處(例如檢定257nm時，檢測器波長先調到252nm),改變檢測器波長，每(5～10)s改變1nm,記錄每個波長下的吸收值(吸收值變化的示意圖見圖3),最大或最小吸收值對應的波長與參考波長之差為波長示值誤差。每個波長重復測量3次，其中最大值與最小值之差為波長重復性。圖3波長示值誤差檢定中吸收值變化示意圖有吸光值顯示的檢測器，改變波長時可直接讀出吸光值，其最大(或最小)吸光值對應的波長與參考波長之差為波長示值誤差。有波長掃描功能的儀器可畫出標準溶液的光譜曲線，其波峰(或波谷)對應的波長與參考波長之差為波長示值誤差。對于有內置標準濾光片可進行自檢的儀器可直接采用其測量數據。對改變波長有自動回零功能的紫外-可見光檢測器，可采用連續進樣的方法檢定波長示值誤差，具體做法是：用一節空管代替色譜柱將液路連通，以水做流動相，流量為(0.5～1.0)mL/min,采用步進進樣方法，例如檢定257nm時，從252nm開始到262nm,每2min改變1nm,用注射器注入相同體積的紫外分光光度計溶液標準物質，得到一組不同波長的色譜峰，最高(或最低)色譜峰對應的波長與參考波長之差，即為b)基線噪聲和基線漂移選用Ci?色譜柱，以100%甲醇為流動相，流量為1.0mL/min,紫外檢測器的波長設定為254nm,檢測靈敏度調到最靈敏擋。開機預熱，待儀器穩定后記錄基線30min,選取基線中噪聲最大峰-峰高對應的信號值，按公式(7)計算基線噪聲，用檢測器自身JJG705—20148的物理量(AU)作單位表示。基線漂移用30min內基線偏離起始點最大信號值(AU/30min)表示。N?——檢測器基線噪聲K——衰減倍數B測得基線峰-峰高對應的信號值，AUc)最小檢測濃度在6.2.2.4中b)的色譜條件下，由進樣系統注入(10～20)μL的1.00×10-7g/mL萘-甲醇溶液，記錄色譜圖，由色譜峰高和基線噪聲峰高，按公式(8)計算最小檢測濃N?——基線噪聲峰高c——標準溶液濃度，g/mLH——標準物質的峰高。d)線性范圍將檢測器和數據處理系統連接好，檢測器波長設定為254nm,通電穩定后，用注射器直接向檢測池中注射2%異丙醇-水溶液沖洗檢測池至示值穩定后，記下此值。然后，依照上法向檢測池中依次分別注入丙酮-2%異丙醇系列水溶液(丙酮含量為0.1%,0.2%,…,1.0%),并記下各溶液對應的穩定響應信號值，每個溶液重復測量3次，取算術平均值。以5個丙酮溶液濃度(0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%)和對應的響應信號值做標準曲線，在曲線上找出丙酮溶液濃度大于0.5%各點的讀數；與相應各濃度點的測量值做比較，量值相差5%時的濃度作為檢測上限CH。按6.2.2.4中c)得到的最小檢測濃度為檢測下限C.值，Cn/C.比值為線性范圍。6.2.2.5熒光檢測器性能a)波長示值誤差和重復性固定波長熒光檢測器波長示值誤差和重復性的檢定，需取出檢測器中的濾光片，參照JJG537—2006《熒光分光光度計》5.3.3的方法(參見附錄B),在經檢定合格的紫外-可見分光光度計上測出其最大透射比對應的波長，此波長與濾光片上標記的波長之差，為波長示值誤差。可調波長熒光檢測器波長示值誤差和重復性的檢定，將檢測器與數據處理系統連接好，利用萘在290nm(激發波長)和330nm(發射波長)有最大熒光強度的特性，用JJG705—20149其充滿。調激發波長為290nm,改變發射波長，從325nm到335nm,每(5～10)s改變1nm,記錄每個波長下的吸收值(吸收值變化的示意圖類似圖3),曲線最高點對應的波長與參考波長之差，為發射波長示值誤差，重復測量3次，其最大值與最小值之差為波長重復性。然后將發射波長調到測得的曲線最高點對應的波長，改變激發波長定后，記錄基線30min,根據檢測器的衰減倍數和測得的基線峰-峰高對應的響應信號值，按公式(7)計算基線噪聲，用檢測器自身的物理量(FU)做單位表示；基線漂移c)最小檢測濃度在6.2.2.5中b)的色譜條件下，待基線穩定后由進樣系統注入(10～20)μL的1.00×10~7g/mL(或1×10-8g/mL)的萘-甲醇溶液，記錄色譜圖，按公式(8)計算d)線性范圍1×10-*g/mL的萘-甲醇溶液，記下每種溶液對應的響應信號值，重復測量3次，取平均值。以5個萘-甲醇溶液濃度(1×10-5～5×10-5)g/mL和對應的響應信號值作標量值做比較，兩值相差5%時的萘-甲醇溶液濃度為檢測上限C,6.2.2.5中c)得到的注：熒光檢測器性能的檢定過程中使用的1×10-5g/mL、1×10-6g/mL和1×10-8g/mL的萘-甲醇溶液可用1.0×10-4g/mL的萘-甲醇溶液標準物質稀釋而得。a)基線漂移和基線噪聲選用C?g色譜柱，將儀器各部分連接好，以甲醇為流動相，流量為1.0mL/min,參比池充滿流動相，靈敏度選擇在最靈敏擋，接通電源，待儀器穩定后記錄基線30min,根據檢測器的哀減倍數和測得的基線峰-峰高對應的響應信號值，按公式(7)計算基線噪聲，用檢測器自身的物理量(RIU)表示；基線漂移用30min內基線偏離過2℃)。b)最小檢測濃度在6.2.2.6中a)的色譜條件下，待基線穩定后由進樣系統注入(10～20)μL的5.0μg/mL的甲醇中膽固醇溶液標準物質，記錄色譜圖，按公式(8)計算最小檢測濃JJG705—2014c)線性范圍將檢測器與數據處理系統連接好，用甲醇反復沖洗樣品池與參比池，并充滿參比池，儀器穩定后記下響應信號值。依次向樣品池中注入1×10-*g/mL,2×10-*g/mL,…,10×10~4g/mL甲醇中膽固醇溶液，記下上述各濃度溶液對應的響應信號值，重復測量3次，取平均值。以5個甲醇中膽固醇溶液濃度(1×10-4～5×10-4)g/mL和對應的響應信號值作標準曲線，在曲線上找出甲醇中膽固醇溶液濃度大于5×10~*g/mL各點對應的讀數，與相應各濃度點的測量值做比較，兩值相差5%時的甲醇中膽固醇溶液濃度為檢測上限CH,6.2.2.6中b)得到最小檢測濃度為檢測下限Cn,Cn/Cn之比值為線性范圍。6.2.2.7蒸發光散射檢測器性能a)基線漂移和基線噪聲選用C??色譜柱，將儀器各部分連接好，以甲醇為流動相，流量為1.0mL/min漂移管溫度70℃(低溫型35℃),霧化氣體流速為(2.5～3.0)L/min或適當的氣體壓力(280～350)kPa,靈敏度選擇在適當的擋位，接通電源，待儀器穩定后記錄基線30min,根據檢測器的衰減倍數和測得的基線峰-峰高對應的響應信號值，按公式(7)計算基線噪聲，用檢測器自身的物理量(mV)表示；基線漂移用30min內基線偏離起始點最大響應信號值(mV/30min)表示。b)最小檢測濃度在6.2.2.7中a)的色譜條件下，待基線穩定后由進樣系統注入(10～20)μL的5.0μg/mL(5.0×10~6g/mL)的甲醇中膽固醇溶液標準物質，記錄色譜圖，按公式(8)計算最小檢測濃度CL。6.2.2.8整機性能(定性、定量重復性)將儀器各部分聯接好，選用C色譜柱，用100%甲醇為流動相，流量為1.0mL/min,根據儀器配置的檢測器，選擇測量參數：紫外-可見光檢測器和二極管陣列檢測器波長設定為254nm,靈敏度選擇適中，基線穩定后由進樣系統注入一定體積的1.0×10-4g/mL萘-甲醇溶液標準物質；熒光檢測器激發波長和發射波長分別設定為290nm和330nm,靈敏度選在中間擋，基線穩定后注人一定體積的1×10-5g/mL萘-甲醇標準溶液；示差折光率檢測器和蒸發光散射檢測器靈敏度選在中間擋，注入一定體積的200pg/mL(2.0×10-4g/mL)的甲醇中膽固醇溶液標準物質。連續測量6次，記錄色譜峰的保留時間和峰面積，按公式(9)計算相對標準偏差RSDsRSDs定性(定量)——定性(定量)測量重復性相對標準偏差；X:第i次測得的保留時間或峰面積；X6次測量結果的算術平均值；i——測量序號；6.3檢定結果6.3.1按本規程條款檢定，全部檢定項目(詳見第4章)均達到規定技術要求的儀器6.3.2只配一個檢測器的儀器，任何一個檢定項目不合格，該儀器為不合格儀器，發給檢定結果通知書，注明不合格項。6.3.3配一個以上檢測器的儀器，只要其中一個檢測器的檢定項目和除檢測器外其他檢定項目合格，可發給配該檢測器的儀器檢定證書。同時注明其他不合格的檢測器，限6.4檢定周期儀器的檢定周期一般不超過2年，更換重要部件或對儀器性能有影響時，應重新色譜柱性能測試A.1液相色譜柱A.1.1柱效反相色譜柱的理論塔板數一般在(3×10?~4×10?)m-1范圍內，正相色譜柱的理論塔板數在(4×10?~5×10?)m-1范圍內。A.1.2色譜峰對稱性：被測峰(蒽)的不對稱因子As一般在0.8～1.6范圍內。A.2色譜柱性能測試方法A.2.1測試條件和標準溶液色譜柱性能測試條件和液相色譜儀的檢定條件基本相同。反相色譜柱測試用的標準溶液為1×10-4g/mL尿嘧啶、1×10-5g/mL聯苯和蒽(萘)的甲醇溶液，正相色譜柱測試用的標準溶液為1×10-2mL/mL甲苯和1×10~4mL/mL硝基苯的正己烷溶液。A.2.2柱效的測試方法將被測試的色譜柱接到檢定合格的液相色譜儀器上，反相柱用甲醇十水(85%+15%)為流動相，流速為1mm/s(內徑為4.6mm色譜柱，流量為1.0mL/min),紫外檢測器波長為254nm,靈敏度選擇適中。按說明書操作，開啟儀器穩定后，從進樣口注入10μL反相色譜柱測試標準溶液，記錄色譜圖(如圖A.1),由公式(A.1)計算色譜柱效，重復測量3次，取平均值。(A.1)W?——色譜峰半高峰寬，min;正相色譜柱的柱效測試條件和方法與反相色譜柱基本相同，只是流動相為正己烷十異丙醇(99.5%+0.5%),注入正相色譜柱測試標準溶液。A.2.3色譜峰對稱性的計算在A.2.2測得的色譜圖中，按公式(A.2)計算色譜峰的不對稱因子As。As=b/a(A.2)a,b分別為通過峰高處、平行于峰底的直線被峰兩側及峰高截取的兩線段的長度(見圖A.1)。圖A.1標準色譜圖附錄B單色器濾光片的性能測試用紫外-可見分光光度計測量被檢儀器的濾光片在各波長處的透射比，繪制透射比波長特性曲線(見圖B.1)。由曲線求出最大透射比T對應的波長λ,則濾光片峰△λ=λ-λmx(B.1)3B.2截止型濾光片波長示值誤差截止型濾光片的透射光特性用半高波長表示。測量方法同B.1,由圖B.2所示曲線求出最大透射比Tmx,Tmx/2所對應的波長λ?為半高波長。附錄C不同溫度下流動相密度不同溫度下純水的密度見表C.1.單位為g/cm單位為g/cm30注：該純水的密度表采用國際溫標(ITS-90)的純水密度表C.2純甲醇的密度不同溫度下純甲醇的