PAGE1-目錄31842_WPSOffice_Level1摘要 118040_WPSOffice_Level1前言 412898_WPSOffice_Level1概述 55069_WPSOffice_Level11.腦卒中研究進展 513571_WPSOffice_Level21.1腦卒中研究概況 58750_WPSOffice_Level21.2發病機制 517591_WPSOffice_Level31.2.1炎癥反應 518859_WPSOffice_Level31.2.2腦血管上皮細胞功能異常及酸中毒 513585_WPSOffice_Level31.2.3自由基損傷 61097_WPSOffice_Level31.2.4細胞內鈣離子過量 68662_WPSOffice_Level31.2.5凋亡基因的激活 610562_WPSOffice_Level21.3腦卒中臨床治療 611703_WPSOffice_Level31.3.1西醫藥治療 624411_WPSOffice_Level31.3.2中醫藥治療 78154_WPSOffice_Level12.通圣片研究進展 826316_WPSOffice_Level22.1牛黃 87828_WPSOffice_Level22.2大黃 88084_WPSOffice_Level22.3虎杖 830976_WPSOffice_Level22.4山梔子 85927_WPSOffice_Level22.5赤芍 815968_WPSOffice_Level22.6厚樸 9218_WPSOffice_Level22.7天竺黃 96502_WPSOffice_Level22.8防風 922149_WPSOffice_Level13.網絡藥理學研究進展 922227_WPSOffice_Level1研究部分 102844_WPSOffice_Level11.研究內容 1031251_WPSOffice_Level12.技術路線圖及研究方法 1018276_WPSOffice_Level22.1疾病-藥物-靶點網絡構建 116082_WPSOffice_Level22.2網絡分析 1210468_WPSOffice_Level13.結果 1211576_WPSOffice_Level23.1CIRI-藥物-靶點網絡 1232193_WPSOffice_Level23.2CIRI-藥物-共同靶點網路 139612_WPSOffice_Level23.3TNF通路和細胞凋亡通路網絡 163116_WPSOffice_Level14.討論 1632693_WPSOffice_Level15.結論 1710888_WPSOffice_Level1【參考文獻】 1726292_WPSOffice_Level1致謝 1917-基于網絡藥理學研究通圣片治療腦缺血的機制【摘要】目的：通過網絡藥理學預測通圣片（TSTs）治療腦缺血再灌注損傷（CIRI）的關鍵靶點和主要通路，探索其治療CIRI的作用機制，為通圣片的臨床應用提供科學依據。方法：首先，在實驗前期，采用高效液相色譜法測定了通圣片的11個特征峰，進一步篩選出10種效應成分，然后分別使用ChemDISv2.4和Pubchem生物測定數據庫檢索出通圣片中10種效應成分的621個潛在靶點；通過開放靶點驗證平臺，收集了腦缺血再灌注損傷的890個相關治療靶點；采用Cytoscape軟件，將CIRI靶點與藥物-靶點網絡進一步融合，形成了一個綜合性疾病-藥物-靶點網絡；使用圖聚類算法TFIT來識別網絡中的功能集群，并使用ReactomeFICentoscape插件的網絡豐富了與此相關的路徑；最后對網絡進行結果分析。結果：通圣片的效應成分與CIRI的相關治療靶點一共有111個靶點重疊，主要作用于氧化應激的NO和Nrf2通路、炎癥相關IL-1β和TNF通路、以及凋亡相關Bcl-2和Cyt-C通路，通過綜合調控這些靶點和通路，從而發揮其藥理效應，減輕腦缺血再灌注損傷。結論：TSTs治療CIRI的作用機制與抗氧化應激、抗炎和抑制細胞凋亡有關。TSTs是一種潛在的腦缺血再灌注治療藥物。【關鍵詞】網絡藥理學；通圣片；腦缺血再灌注損傷ExploringmechanismofTongshengTabletintreatingCerebralIschemiabasedonNetworkPharmacology【Abstract】Objective:TheobjectiveofthisprojectaimstoidentifypotentialactivecomponentsofTongshengtabletandpredicttheirassociationswiththecerebralischemiareperfusioninjury（CIRI）.WehypothesizedthattheactiveelementsofTongshengtabletcouldtargetonthedrivingsignalingofCIRI.Method:Firstly,intheearlystageoftheexperiment,11characteristicpeaksofTongshengtabletsweredeterminedbyHPLC,and10possiblecompoundswerefurtherscreenedout.Next,toidentifythepotentialtargetsofTongshengtablet,621potentialtargetsof10possiblecompoundsinTongshengtabletwereretrievedbyChemDISv2.4andPubchembioassaydatabase,respectively.Toassociatethetherapeutictargetwiththecondition,890relevanttherapeutictargetsofcerebralischemiareperfusioninjurywereretrievedthroughtheOpenTargetsValidationPlatform.UsingCytoscapesoftware,CIRItargetwasfurtherfusedwithdrug-targetnetworktoformacomprehensivedrug-target-CIRInetwork.InextidentifiedcriticalTongshentabletcomponentswhichprobablytargetingCIRIdrivingsignalingbyoverlappingthedrugtargetswithCIRIassociatedproteins.Finally,thegraphclusteringalgorithmTFITwasusedtoidentifythefunctionalclusterswithinthisnetwork,andenrichedthepathwaysimplicatedinthisnetworkusingReactomeFICytoscapeplugin.Results:TheeffectorcomponentsofTongshenTabletmainlyactontheNOandNrf2pathwaysofoxidativestress,theinflammation-relatedIL-1βandTNFpathways,andtheapoptosis-relatedBcl-2andCyt-Cpathways.Bycomprehensivelyregulatingthesetargetsandpathways,Tongshengtabletcanexertitspharmacologicaleffectsandreducecerebralischemiareperfusioninjury.Conclusion:TheroleofTSTsinthetreatmentofCIRIisrelatedtotheanti-oxidativestress,anti-inflammatoryandinhibitionofcellapoptosis.ThisstudysuggeststhatTSTsisapotentialtherapeuticdrugforcerebralischemiareperfusioninjury.【Keywords】Networkpharmacology;TongshengTablets;Cerebralischemiareperfusioninjury前言缺血性腦卒中(Cerebralischemicstoke,CIS)也就是常說的“腦梗死”，目前已經成為一種嚴重危害中老年人健康的疾病[1]。在CIS的治療中，有必要恢復或增強缺血區域的血液供應，以盡量減少缺血對中樞神經系統細胞結構和功能的損害[2]。有許多研究表明，如果病情不及時治療，會進一步損傷腦組織神經，形成腦缺血再灌注損傷（CIRI）。因此，抑制再灌注損傷也是治療CIS重要的部分之一[3-4]。組織型纖溶酶原激活物（tPA）作為目前治療CIS的唯一有效藥物，其應用時間受到一定的限制，因此許多患者不能及時接受溶栓治療，從而進一步損傷腦組織，出現不可逆損傷[5]。目前CIRI的藥物治療主要是依靠單一藥物，因此，發現一種安全有效的藥物治療CIRI非常重要。通圣片（TSTs）是一種用于急性缺血腦卒中的復方制劑，由大黃、防風、山梔子、牛黃、天竺黃、虎杖、赤芍、和厚樸組成。有研究表明，牛黃具有抗炎，抗氧化作用，還可以通過抑制中樞興奮起到鎮靜作用，因此常應用在腦血管疾病的治療中[6]。大黃具有抗凝血、消炎、利濕退黃等多種功效，對于治療腦卒中有一定的輔助作用。虎杖通過有效的抵抗自由基過多而引起的損傷，提高腦組織抗氧化的能力從而起到保護腦缺血的作用[7]。赤芍可通過調節機體抗氧化應激能力，從而起到抗CIRI的作用。梔子主要成分梔子苷可通過影響自由基、抑制內皮細胞的損傷和神經保護的作用等來治療腦血管疾病[8]。厚樸酚和防風的色原酮、多糖等成分都具有明顯的抗炎、抗氧化的作用，可以清除體內多余的自由基，保護細胞膜。天竺黃在中醫藥運用上可用于治療中風痰壅、熱病神昏等腦血管疾病。網絡藥理學基于系統生物學的理論，從整體的角度去探索藥物與疾病之間的關聯，通過研究不同的靶標以及作用道路，來明確藥物治療相關疾病的作用機制，實際上是為新藥研發提供證據。先是對藥物活性分子的篩選以及靶點的確定，然后檢索出疾病的相關治療蛋白，構建藥物-疾病-靶點網絡，最后通過網絡的富集以及分析，挖掘網絡中的關鍵節點，在分子的水平上闡明藥物效應成分與疾病治療靶點之間的效應關系以及潛在機制。而這正好符合中藥復方多成分，多靶標協和作用的特點，使得復方發揮療效具有整體性[9]。因此，網絡藥理學的應用有利于揭示中藥復方在治療某些疾病上的效應機制，也為未來新藥研發指明道路。概述腦卒中研究進展1.1腦卒中研究概況腦卒中（Stroke）俗稱為中風，因為多種原因，腦部血管受損導致出血或者阻塞，造成的局灶性或者整體性腦部組織損傷，嚴重時可致死亡。腦卒中可分為缺血性腦卒中（腦梗死）和出血性腦卒中，其中，據統計缺血性腦卒中占85%左右[10]。當長時間腦部缺血，恢復血液供應時，會產生過量的自由基，攻擊這部分恢復血液供應的腦組織，就會形成腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷一旦進展嚴重，很有可能會發生微血管的損傷或者神經的損傷。在CIRI的發病機制中，主要是有自由基的大量生成、細胞內鈣超載、生物膜損傷、由白細胞增加引起的炎癥反應、凋亡基因激活等[11]。這些機制相互作用，彼此聯系，從而形成惡性的循環，最終導致缺血部位的腦組織不可逆的損傷[12]。而在中醫辨證上，腦卒中屬于頭痛眩暈的范疇中，其病機可以描述為腦供血不足，腦絡失和，氣虛血瘀，痹阻脈絡等[13]。1.2發病機制腦卒中發病機制如是一個級聯反應，各種因素相互聯系，相互作用，其中包括了炎性反應、腦血管上皮細胞功能異常及酸中毒、自由基損傷、細胞內鈣離子過量等。接下來就腦卒中的主要發病機制研究作一綜述。1.2.1炎癥反應有研究表明，細胞腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）在引起血管疾病中起著重要的作用。當炎性因子大量生成，血管內皮的炎癥發生幾率增加，大量的活性氧也隨之產生，血腦屏障遭到破壞，神經元發生凋亡，最終病情也會越來越嚴重。而且當炎性因子CPR異常時，患者會出現預后較差的現象，在臨床上，病情的癥狀表現也會比一般患者要嚴重[14]。1.2.2腦血管上皮細胞功能異常及酸中毒當腦組織出現連續的供氧、供血障礙時，腦血管上皮細胞的自主調節能力就會受到影響，最終導致腦卒中的發生。另外，腦組織的缺氧、缺血狀態還會影響線粒體的結構，使其代謝有有氧轉化為無氧，產生大量的乳酸，造成腦組織酸中毒甚至導致腦能量耗竭，最終誘導腦組織細胞的死亡[15]。1.2.3自由基損傷發生腦梗死之后，在缺血缺氧的刺激下，細胞膜會釋放出花生四烯酸，從而在代謝過程中產圣大量的自由基，自由基進一步進攻腦組織的細胞內皮，使得其功能紊，出現腦細胞壞死，腦水腫等現象，最終誘發腦卒中[16]。1.2.4細胞內鈣離子過量細胞內的鈣離子超載的損害途徑是當大量的Ca2+生成時，會激活磷脂酶A2和磷脂酶C，導致磷膜脂發生降解，產生大量的脂肪酸。而這些脂肪酸在代謝的過程中會導致腦組織的自由基釋放增加，使得細胞內皮進一步損害，最終該部位的功能亦受到了影響[17]。另外，當大量Ca2+大量沉積于線粒體時，能量產生受到障礙，也會加重病情[18]。1.2.5凋亡基因的激活與腦卒中發病機制相關的凋亡相關因子主要是Caspases蛋白家族、B細胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcl-2）蛋白家族和細胞色素C（cytochromecomplex，Cyt-c）。活化的Caspases蛋白通過影響線粒體膜的通透性，促進凋亡因子的釋放，導致腦細胞的凋亡；當促凋亡因子Bax的表達增強，抗凋亡因子Bcl-2的表達被抑制時，腦卒中的細胞就會進入凋亡程序；當Cyt-c因子的表達升高時，也會進一步損傷腦細胞，加重病情[19]1.3腦卒中臨床治療針對以上的發病機制，腦缺血的臨床治療主要是通過抑制炎性因子表達水平，恢復血供能力，清除多余自由基以及保護神經元等來達到治療作用。目前，在臨床上西醫藥治療腦缺血主要包括抗血栓藥物、自由基消除劑、抗凝和降纖治療、以及維持神經結構完整性的保護劑等[20]。而在中醫藥治療上，主要是以活血化瘀類的藥物為主，通過抑制血小板聚集增加血液的流動性從而增加腦灌注量、以及通過提高腦部組織對缺氧的耐受能力。1.3.1西醫藥治療1.3.1.1溶栓治療目前關于缺血性腦卒中（CIS）在急性期的臨床治療最有效以及應用最廣的是溶栓治療及其使用的藥物主要有組織型纖溶酶原激活物（t-PA）、重組組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）、纖維蛋白溶解劑尿激酶等。而t-PA早在1996年就被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準為第一個而且是唯一一個用于CIS急性期的的溶栓藥物[21]。但是由于這個藥物在使用上的各個方面的局限性，使得發生危險副作用的幾率大大提高，因此其在臨床上的使用是很受限的。1.3.1.2抗血小板聚集治療抗血小板聚集主要的通過改善CIS患者腦部的血液流動情況，抑制或者治療血栓的形成，使得血供恢復正常來起到治療作用。目前臨床上抗血栓形成的藥物只有氯吡格雷、奧扎格雷和阿司匹林等[22]。1.3.1.3抗凝和降纖治療抗凝和降纖的治療機制主要是通過降低血漿纖維蛋白原、溶解血栓以及抑制血栓的形成來發揮作用。常用的藥物包括了華法林、肝素、安克洛酶等。但是對于急性期的缺血性腦卒中患者來說，不推薦無選擇地早期進行抗凝治療。所以目前在臨床上，這些藥物的使用是要根據具體情況個體化使用[23]。1.3.1.4神經保護治療針對CIS的發病機制，目前臨床上傷神經元保護劑主要包括了自由基清除劑、炎癥反應抑制劑、鈣通道阻滯劑等。其作用機制主要是通過抑制缺血后半暗帶區不正常的病理反應，阻斷或者延遲發病級聯反應的各個過程，起到保護神經元的作用[24]。但是，在臨床試驗研究中，神經保護劑的治療均得到陰性結果，多種神經保護劑在CIS的治療效果仍然缺乏明確的證據。1.3.2中醫藥治療中醫學對腦卒中的病因病機的認識以及辯證施治原則在治療中起了重要的作用。通過中醫來治療腦卒中是我國中醫學長久積累下來的寶貴財富，有研究表明，不管是單味藥的治療還是復方藥的治療，均在治療腦卒中這一領域上取得了不錯的效果[25]。在單味藥的研究中，潘桂生[26]通過提取銀杏葉的內酯類化合物以及黃酮類化合物，發現它們具有抗血小板聚集的作用，還可以改善患者腦缺血部位的微循環，恢復血供能力以及抑制血栓的形成，在腦部疾病的治療中取得良好的效果。王成建[27]在研究中發現在缺血性腦卒中的恢復期出現的氣虛血瘀現象，自己研制的益氣活血通絡方劑治療效果良好，能夠改善凝血指標水平和降低炎性標志物。此外，中醫其他療法在腦缺血治療上同樣取得很好的效果。針灸療法療效都比較明確，而且操作的條件也比較簡單，安全有效，副作用比較少。有研究表明，在治療中風神經性癱瘓時，頭針聯合康復治療的效果要比單獨的康復治療的效果好很多，總體的有效治療率達到了90%[28]。通圣片研究進展通圣片(TSTs)是經古方安宮牛黃丸（ANW）和防風通圣散組合的中藥復方。TSTs是廣東省東莞市中醫院成功轉化的一種醫院制劑，目前在臨床上用于治療頭暈、精神錯亂和中風等腦卒中相關癥狀[29]。TSTs是由大黃、防風、山梔子、牛黃、天竺黃、厚樸、赤芍、和虎杖組成。現對方中每一味中藥的藥理作用一一做綜述。2.1牛黃牛黃作為制劑中的君藥，在現代藥理學有研究表明牛黃通過主要成分牛磺酸穩定細胞膜，清楚氧自由基和調節Ca2+穩態等多種機制，起到保護神經細胞膜，減少細胞凋亡或死亡的作用，從而減緩神經細胞的的衰老和減少細胞的凋亡和死亡[30]。2.2大黃有實驗研究表明，大黃的主要活性成分能夠通過抑制炎性因子TNF-α和IL-1的基因轉錄，從而降低腦組織炎性因子的表達水平，起到治療的作用[31]；此外大黃及其提取物還可以通過降低組織的含水量，減輕CIRI作用，對大鼠腦缺血損傷有保護作用[32]。2.3虎杖虎杖的主要成分為虎杖苷，又稱為白黎蘆醇（Polydatin,PD）。有研究表明，虎杖苷有較強的抗血小板聚集以及抗血栓形成的作用。此外，虎杖苷還具有較強的抗氧自由基作用，抑制一氧化氮合成酶（NOS）活性，減少一氧化氮（NO）的合成以及氧化作用，保護血腦屏障，減輕或抑制腦水腫的形成，起到保護神經元的作用[33]。2.4山梔子山梔子在治療CIS中起主要作用的是梔子苷，亦成為京尼平苷（Geniposide）。據研究表明，京尼平苷具有抗炎的作用，在治療腦血管疾病的多個環節中起著重要的作用，改善腦部的微循環，抑制內皮細胞以及促進神經元保護來提高腦血管疾病的療效[34]。2.5赤芍在人體中，主要的抗氧物質是超氧化物歧化酶（SOD），有研究表明，赤芍能夠提高SOD的活性，減少脂質過氧化物（MDA）以及一氧化氮（NO）的生成，從而起到抗氧化、保護血腦屏障減和神經元、減輕CIRI的作用[35]。2.6厚樸中藥厚樸中重要藥效成分是一種含有酚羥基的厚樸酚(Magnolol,Mag)，因此它是一種較強的自由基清除劑。同時，厚樸酚還具有強效的抗炎作用，在體內，通過調節相關抗氧物質的表達水平，抑制氧化物的形成，從而保護細胞膜免收過量自由基的損傷，發揮抗局灶性腦缺血的作用[36]。2.7天竺黃同樣，有實驗研究表明，天竺黃具有抗炎的作用，主要是通過降低TNF-α、IL-1β、細胞間黏附分子-1(ICAM–1）等相關炎性因子的表達，來保護神經以及血腦屏障，對于減輕腦缺血再灌注損傷的傷害有一定的作用[37]。2.8防風藥理研究表明，中藥防風中的主要藥效成分有色原酮類，香豆素類以及多糖類等，具有抗炎、抗氧化的作用。不同的防風多糖表現出不同的抗氧化活性。其中，對于對羥基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）具有較強的清除能力[38]。因此，防風通過干預腦組織的氧化應激反應，起到保護神經的作用，對于減輕患者的病情具有一定的作用。網絡藥理學研究進展傳統中醫藥學推崇辨證論治，主要從整體角度去確定疾病的類型，然后用方劑來對癥治療。但是常規的方藥含有復雜的成分，使得研究成為了一個棘手的問題。早在2008年，網絡藥理學由Hopkins[39]提出，這是一種基于系統生物學的研究方法，通過構建藥物、疾病以及靶點之間的相互作用網絡，來預測藥物治療相關疾病的效應靶點和作用通路。而在中藥復方中，藥物之間相互配伍，從辨證論治出發，其“整體性”以及“多靶點”的特點是與網絡藥理學的研究方式是不謀而合的[40]。這也促進了傳統復方研究從“單一靶標、單一藥物”的原有模式向“網絡靶標、多組分藥物”模式的轉化[41]。如今，網絡藥理學已經被應用于研究一些疑難雜病發病機制、以及新藥研發、相關靶點通路的探測等領域[42]ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kibble</Author><Year>2015</Year><RecNum>26</RecNum><DisplayText>(Kibbleetal.,2015)</DisplayText><record><rec-number>26</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="92vzd2vtgrrdaqexwwa5v0wtfpssz0vsdxee">26</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kibble,M</author><author>Saarinen,N</author><author>Tang,J.</author><author>Wennerberg,K</author><author>M?kel?,S</author><author>Aittokallio,T</author></authors></contributors><titles><title>Networkpharmacologyapplicationstomaptheunexploredtargetspaceandtherapeuticpotentialofnaturalproducts</title><secondary-title>NaturalProductReports</secondary-title></titles><periodical><full-title>NaturalProductReports</full-title></periodical><pages>1249-1266</pages><volume>32</volume><number>8</number><dates><year>2015</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>。在對于復方中藥的研究中，通過網絡藥理學的方法，還可以更好的對藥效物質基礎進行研究，將復方中復雜的藥效成分及其藥理作用，以及潛在靶點進行更加準確的預測[43]。通過分子對接和生物網絡識別的應用，可以構建復方中重要成分跟靶點之間的關系網，能夠有效的解釋復方在治療一些復雜疾病的作用機制。除此之外，通過數據庫獲取化合物和疾病相關治療靶點，利用相關軟件構建化合物-疾病靶標-蛋白質網絡，通過對網絡的富集分析，就可以了解到復方中的某些有效成分通過何種作用機制來治療疾病。因此，在研究復方中藥的過程中，網絡藥理學的應用，能夠對于藥效物質基礎以及作用機制進行有效準確的研究，也同樣使得復方的使用更加有針對性，對于治療復雜疾病也有更好的效果。雖然目前許多研究集中在TSTs所涉及的草藥或其單體上，但關于TSTs全面的研究很大程度上仍然是未知的。同時TSTs的多靶點、多途徑的特點也使得研究更加困難。最后本實驗采用網絡藥理學和生物信息學綜合分析的方法來預測通圣片治療CIRI的作用機制。從11種高效液相色譜鑒別的成分中篩選出10種可能的效應成分，利用現有的數據庫檢索出成分的潛在靶點，再結合CIRI相關治療靶點，嘗試構建一個綜合性疾病-藥物-靶點網絡，通過對網絡進行結果分析，進一步確定TSTs在治療CIRI上的關鍵靶點和作用通路，發現其治療的可能機制，為TSTs的臨床應用提供科學依據。研究部分研究內容本研究通對通圣片含有的11種成分進行初步篩選，篩選出10種效應成分，利用相關數據庫檢索出這些效應成分的核心靶點，結合CIRI的相關治療靶點，構建成分-靶點-疾病網絡。通過對網絡的分析，預測通圣片治療CIRI的信號通路，探索其核心靶點和藥效生物網絡，進一步明確通圣片治療腦缺血的關鍵靶點和可能的機制。技術路線圖及研究方法圖1實驗流程圖Fig.1Experimentalflowchart2.1疾病-藥物-靶點網絡構建ChemDIS是一種用來檢索成分-蛋白質相互作用的工具，可用于參考成分-疾病之間的關系[43]。PubChemBioAssay[44]是一個小分子數據篩選的倉庫，可以提供化合物的生物效應。為了確定通圣片的潛在靶點，分別使用ChemDISv2.4從Stitch數據庫v5.0中檢索通圣片中11種重要化合物的相互作用蛋白以及使用PubChemBioAssay數據庫檢索出其生物靶點。在檢索時，為了提高置信度，ChemDISv2.4結果的得分截止值設置為0.4。最后將檢索出來的成分-蛋白質相互作用和小分子生物靶點均整合到藥物靶標網絡中，構建化合物-靶點網絡，并使用Cytoscape3.6.1軟件對該網絡進行分析和可視化處理。開放靶點驗證平臺（TheOpenTargetsValidationPlatform）[45]是一個整合各種證據以幫助藥物靶點識別和驗證的平臺，收集有關疾病的相關蛋白，為已知潛在藥物靶點與疾病的關聯提供證據。為了將治療靶點與病情聯系起來，先檢索了腦缺血再灌注損傷(CIRI)相關的治療靶點，然后將CIRI治療靶點與藥物的靶標進一步的整合，形成一個綜合性的疾病-藥物-靶點網絡。2.2網絡分析明確藥物靶點與CIRI疾病的關系，我們提取了10種化合物和CIRI疾病的共同靶點，構建了一個CIRI-藥物共同靶點網絡。接下來，在Cluster&See[46]中使用圖聚類算法TFit(用于迭代轉移融合)來識別網絡中的功能集群，并使用Cytoscape中的ReactomeFI插件來豐富網絡中涉及的通路。圖片使用Cytoscape3.6.1.軟件做出。結果3.1CIRI-藥物-靶點網絡在實驗前期，對通圣片含有的11種成分進行初步篩選，篩選出10種效應成分，分別是芍藥苷（Paeoniflorin）、虎杖苷（Polydatin）、大黃酸（Rhein）、京尼平苷（Geniposide）、大黃酚（Chrysophanol）、厚樸酚（Magnolol）、大黃素甲醚（Physcion）、升麻苷（Prim-O-glucosylcimifugin）、蘆薈大黃素（Aloeemodin）、大黃素（Emodin）。以及使用相關數據庫檢索出這些效應成分共同調節的621個潛在靶點和CIRI的890個相關蛋白。采用Cytoscape軟件將藥物靶點和與CIRI的相關蛋白對形成了一個完整的疾病-藥物-靶點網絡(見圖2)。圖2疾病-藥物-靶點網絡Fig.2Disease-Drug-Targetnetwork3.2CIRI-藥物-共同靶點網路通圣片的效應成分的相關靶點與CIRI相關靶點有111個靶點重疊，接著我們構建了一個CIRI-藥物-共同靶點網絡圖(見圖3)。再通過對網絡進行聚類分析，得到了3個主要的功能基團(見圖4)。其中芍藥苷（Paeoniflorin）、大黃素（Emodin）、虎杖苷（Polydatin）聚類為缺血再灌注損傷組。而大黃酚（Chrysophanol）、大黃素甲醚（Physcion）、大黃酸（Rhein）、升麻苷（Prim-O-glucosylcimifugin）、厚樸酚（Magnolol）、京尼平苷（Geniposide）等6種成分均聚在另外兩組。圖3CIRI-藥物-共同靶點網絡Fig.3CIRI-Drug-CommonTargetnetwork圖4在CIRI-藥物-共同靶點網絡中的功能基團Fig.4functionalgroupsinCIRI-Drug-CommonTargetnetwork3.3TNF通路和細胞凋亡通路網絡通過CIRI-藥物-共同靶點網絡中富集的372條通路，預測這些信號通路可能是通圣片治療CIRI的潛在靶點。圖5A和圖5B顯示了其中兩種具相關度較高而且目前研究較透徹的信號通路：腫瘤壞死因子（TNF）信號通路和細胞凋亡信號通路。圖5TNF通路和細胞凋亡通路網絡Fig.5TNFpathwayandApoptosispathwayNetwork討論TSTs在臨床上常用于急性期的CIS。但其對缺血再灌注的作用機制尚不清除。由于通圣片中含有8種中草藥，每一種中草藥都含有復雜的化合物成分，因此，探討通圣片治療CIRI的多靶點、多通路的作用機制有積極的意義。本研究通過在實驗前期HPLC指認的11個成分，進一步篩選出10個效應成分，檢索出其一共621個潛在靶點，然后檢索出CIRI的890個相關治療靶點，將CIRI治療靶點與藥物的靶標進一步的整合，構建出一個綜合性的CIRI-藥物-靶點網絡，由圖2可見通圣片的效應成分作用靶點通過不同的代謝通路，相互聯系、協調，從不同的維度提示著治療CIRI的作用機制。研究表明，隨著炎性因子的大量的釋放，過量的活性氧也隨之產生，神經損傷嚴重，腦卒中的病情也會隨之加重。因此，通過建立CIRI-藥物-共同靶點網絡，實驗結果所示，通圣片治療CIRI的效應機制可能與NFE2L2、IL-1β、TNF、NOS1、NOS2、NOS3、Bcl-2等靶標基因相關。通過對網絡進行聚類分析，其中芍藥苷（Paeoniflorin）、大黃素（Emodin）、虎杖苷（Polydatin）聚類為缺血再灌注損傷組，從結果分析可見它們的靶點與CIRI疾病有更多的聯系，主要表現在抗氧化以及抗細胞凋亡的機制上，因此，它們更可能是通圣片治療CIRI的活性成分；而通圣片其余6中成分聚集在另外兩組，它們在治療CIRI上可能有更多相似的作用機制，例如抗炎癥反應。通過富集通路，結果分析顯示通圣片治療CIRI的效應通路主要富集在MAPK信號通路、鈣信號通路、神經活性配體-受體相互作用等，其中最具代表性的是TNF信號通路以及細胞凋亡通路（見圖5）。研究表明，腫瘤壞死因子（TNF）是一種多效細胞因子，與腦損傷相關的血管變化、炎癥反應、血腦屏障以及血栓的形成相關。因此，TNF表達上升，往往就會導致腦缺血的形成。因此，實驗結果顯示，通圣片治療CIRI的機制之一有可能是通過降低IL-1β和TNF-α來減輕炎癥從而發揮治療作用。同樣，相關研究表明B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）的生理功能是阻遏細胞的凋亡，延長的壽命。線粒體中細胞色素C（Cyt-C）的釋放可以引起凋亡信號的激活，而Cyt-C的釋放是由Bcl-2家族調控線粒體膜透化來調節，因此，在細胞凋亡通路上，通圣片有可能是通過促進Bcl-2的表達，從而降低Cyt-C的表達，從而抑制凋亡中關鍵分子Caspase3的激活，使得細胞凋亡減弱。通過本實驗網絡預測分析的結果顯示，通圣片的主要成分主要作用于氧化應激的NO和Nrf2通路、炎癥相關因子IL-1β和TNF以及Bcl-2和Cyt-C凋亡信號靶點，通過綜合調控這些靶點，從而發揮其藥理效應，減輕缺血再灌注損傷，發揮神經保護作用，促進神經功能缺損情況的恢復。由于實驗的局限性，以及目前對缺血再灌注損傷自噬機制的研究很少，所以在復合靶點疾病網絡中，自噬很難被識別，網絡分析的結果仍需要進一步的實驗驗證。結論綜上所述，實驗研究表明，TSTs在治療CIRI的作用機制上，各種成分相互協調配伍，在不同的的靶標和通路上發揮著治療作用，包括減少氧化應激、抑制炎癥、調節細胞凋亡。提示TSTs是一種潛在的腦缺血再灌注治療藥物。【參考文獻】Morrisblanco,K.C.,Lopez,etal.2017.ImpactofmicroRNAsonischemicstroke:Frompre-topost-disease.ProgressinNeurobiology.Ginsberg,M.D.,2016.Expandingtheconceptofneuroprotectionforacuteischemicstroke:Thepivotalrolesofreperfusionandthecollateralcirculation.ProgressinNeurobiology145-146,46-77.LengT.,ShiY.,Xiong,Z.G.,etal.2014.Proton-sensitivecationchannelsandionexchangersinischemicbraininjury:newtherapeutictargetsforstroke?ProgressinNeurobiology115,189-209.LiuP.K.,GrossmanR.G.,Robertson,C.S.,etal.2001.Ischemicinjuryandfaultygenetranscriptsinthebrain.TrendsinNeurosciences24,581-588.HackeW.,KasteM.,BluhmkiE.,etal.2008.Thrombolysiswithalteplase3to4.5hoursafteracuteischemicstroke.JournalofVascularSurgery48,1634-1635.曹紅霞.牛黃及其相關中藥制劑腦保護作用的實驗研究進展[A].甘肅省中醫藥學會.甘肅省中醫藥學會2010年會員代表大會暨學術年會論文匯編[C].甘肅省中醫藥學會:甘肅省中醫藥學會,2010:3.黃斌,王興勇,匡鳳梧等.白藜蘆醇苷對大鼠局灶性腦缺血的保護作用[J].中國急救醫學,2005,25(3):192-193.靳蕊,晉志高.梔子苷治療腦病的研究進展[J].河北聯合大學學報(醫學版),2014,16(02):194-196.JinlongRu,PengLi,JinanWang,etal.TCMSP:adatabaseofsystemspharmacologyfordrugdiscoveryfromherbalmedicines.JCheminformatics,2014,16:13.GouriouY.,DemaurexN.,BijlengaP.,etal.2011.Mitochondrialcalciumhandlingduringischemia-inducedcelldeathinneurons.Biochimie93,2060-2067.呂靜,姜慧萍,王騰飛等腦缺血再灌注損傷主要發病機制的研究進展[J].濱州醫學院學報,2015,38(04):291-293.AmpL.W.,Wilkins,2018.Correctionto:2018GuidelinesfortheEarlyManagementofPatientsWithAcuteIschemicStroke:AGuidelineforHealthcareProfessionalsFromtheAmericanHeartAssociation/AmericanStrokeAssociation.Stroke49,e138.王永炎.中醫內科學[M].6版.上海:上海科學技術出版社,1994：24.高俊杰,陳湛愔.腦卒中的臨床研究進展[J].現代醫用影像學,2017,26(02):337-339+342.TslotouAG，SakorafasGH，AnagnostopoulosG，etal.Sep-ticshock;currentpathogeneticconceptsfromaclinicalper-spective[J].MedSciMonit,2005,11(3):RA76-85.BoneRC,BalkRA,CerraFB,etal.Definitionsforsepsisandor-ganfailureandguidelinesfortheuseofinnovativetherapiesinsepsis[J].Chest,1992,101(6):1644-1655.GhorbaniG.Procalcitoninroleindifferentialdiagnosisofin-fectionstagesandnoninfectioninflammation[J].PakistanJBioSci,2009,12(4):393-396.趙雨娟，劉敬偉.血清降鈣素原在感染性休克的診斷中的應用[J].中國實用醫藥,2014,15(12):111-111.詹宇豪,沈俊明,王智惠等.凋亡相關因子對腦卒中影響機制的研究進展[J].中華災害救援醫學,2015,3(10):588-591.孫瑜，王健，喬夕等缺血性腦血管病與血腦屏障的關系及其臨床用藥研究進展[J].天津藥學,2016,28(03):62-66.段云霞，陳小玉.缺血性腦卒中治療藥物研究進展[J].中央民族大學學報（自然科學版）,2012,21(2):65-70.寶魯爾，額爾敦朝魯.缺血性腦卒中蒙西醫治療現狀[J].內蒙古民族大學學報(自然科學版),2013,28(03):322-324+330+373.陳旭.急性缺血性腦卒中的治療[J].中華老年心腦血管病雜志,2007,9(9):580-583.傅瑜，廖琴.神經保護劑治療缺血性腦卒中的研究進展[J].中國新藥雜志,2011,20(11):973-977.喬婕，唐巍.中醫藥治療腦卒中后肩手綜合征的研究進展[J].中國民族民間醫藥,2015,06:20-23.段云霞，陳小玉.缺血性腦卒中治療藥物研究進展[J].中央民族大學學報（自然科學版），2012，21（2）：65-70.寶魯爾,額爾敦朝魯.缺血性腦卒中蒙西醫治療現狀[J].內蒙古民族大學學報(自然