登革病毒病毒復(fù)制復(fù)合體的形成機制

病毒登格病毒（den）是一種小的動物病毒。它的基因是一種單帶正鏈流的病毒，長約11公斤。由單一的開放讀碼框(openreadingframe,ORF)編碼一個約含3400個氨基酸殘基的多聚蛋白(polyprotein),順序為5′-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′,由病毒和宿主蛋白酶負責(zé)對其進行協(xié)同翻譯和翻譯后加工,最后形成3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E蛋白)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。20世紀80年代以來,由登革病毒引起的登革熱和登革出血熱在世界范圍的流行、暴發(fā)日益頻繁,我國南方自1978年以來每隔幾年就暴發(fā)一次。為了有效控制登革熱的傳播和流行,必須對病毒的感染及復(fù)制周期有一個全面的了解。有關(guān)登革病毒生活周期的基礎(chǔ)研究目前越來越深入,本文將對這些研究進展作一綜述。1den病毒中的rgd序列及整合素登革病毒感染的早期現(xiàn)象是病毒的吸附及穿入。病毒吸附蛋白(virionattachmentprotein,VAP)與細胞膜表面特異性病毒受體的結(jié)合往往決定了病毒的組織、細胞親嗜性及隨后的一系列病理反應(yīng),登革病毒的VAP為包膜蛋白E,含494個氨基酸及2個潛在的糖基化位點,12個保守的半胱氨酸殘基,具有多個中和性表位,其中某些表位可能直接參與病毒包膜與宿主細胞的融合過程,其余的表位可能直接參與病毒-細胞受體分子的結(jié)合。在人體內(nèi)DEN病毒侵犯的重要靶細胞類型為單核細胞、組織及骨髓細胞,在這些細胞中較易檢測到高滴度的DEN病毒。DEN病毒與特異性細胞受體的結(jié)合依賴于E蛋白的二聚體結(jié)構(gòu),隨后病毒包膜與細胞膜融合,該過程受包膜附近的低pH介導(dǎo),使E蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變,由二聚體形成三聚體。對登革病毒E蛋白研究的逐步深入推動了細胞特異性受體的研究。黃病毒中TBE病毒E蛋白通過X射線晶體衍射技術(shù)已明確了其三維結(jié)構(gòu)。由于DEN病毒E蛋白與TBE病毒E蛋白具有60%的同源性,通過ProMod及Swiss-Model軟件,可準確預(yù)測DEN病毒E蛋白的三維結(jié)構(gòu)如下:E蛋白以延伸的二聚體形式平躺在病毒表面,折疊成3個不同的區(qū)域,Ⅰ區(qū)是一個β-桶狀中心結(jié)構(gòu),由氨基及羧基端序列產(chǎn)生;Ⅱ區(qū)形成一個延伸的指狀結(jié)構(gòu),可能與E蛋白二聚體的形成及膜融合過程相關(guān),Ⅲ區(qū)為IgG免疫球蛋白樣折疊,由羧基末端區(qū)形成且延伸至病毒表面,具有與粘附分子中的整合素結(jié)合區(qū)域(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),簡稱RGD序列。目前已知口蹄疫病毒(FMDEN)、柯薩奇病毒及腺病毒均通過RGD依賴的方式與整合素結(jié)合進入細胞,因此DEN病毒中的RGD序列的存在使人不由想到這些病毒-細胞間的相互作用與整合素的參與有關(guān)。而實際情況并非如此,黃熱(YF)病毒17D株的包膜蛋白亦具有一個可溶性的外露RGD序列,最近研究表明將RGD序列突變?yōu)镽AD或RAE序列后,能完全破壞RGD序列與整合素的相互作用,將這些突變引入全長cDNA克隆,體外轉(zhuǎn)錄后,將突變體RNA轉(zhuǎn)染C6/36細胞,于30℃培養(yǎng)幾天后,可觀察到細胞病變且培養(yǎng)上清中可檢測到突變病毒子,說明突變的RNA基因組可在蚊細胞內(nèi)復(fù)制和傳播;將此培養(yǎng)上清于37℃接種BHK-21細胞并培養(yǎng),BHK-21細胞可被感染,但不能傳播至鄰近的細胞。此外,加入高濃度體外合成的RGD多肽,也不能阻止YFV-17D感染原代雞胚成纖維細胞。這些結(jié)果表明RGD序列介導(dǎo)的整合素結(jié)合過程在黃病毒與細胞吸附及穿入過程中并不起主要作用。另有實驗表明,MVE病毒在人SW13細胞連續(xù)傳代,獲得的RGD→RGG、RGH突變體是減毒株,究其原因,發(fā)現(xiàn)RGD突變株產(chǎn)生的E蛋白在37℃不穩(wěn)定。以上突變可能影響了E蛋白的折疊過程,也可能使E蛋白不能二聚體化或不能與prM蛋白相互作用,導(dǎo)致了降解,由此可見RGD序列對E蛋白構(gòu)象的維持起重要作用,但黃病毒的細胞受體并非為整合素。Chen等認為DEN病毒與表達在基質(zhì)及細胞膜上的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)的結(jié)合介導(dǎo)了病毒的吸附?？扇苄訥AGs能拮抗重組DEN病毒E蛋白與Vero細胞的結(jié)合過程,如肝素的半數(shù)抑制劑量(ID50)為0.3μg/ml,可見E蛋白與肝素具有較高的親和性。由于肝素并非是細胞膜的組成部分,而與其具有結(jié)構(gòu)同源性的硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)廣泛存在于細胞表面及其基質(zhì),它們的一級結(jié)構(gòu)均為重復(fù)的二糖單位。也許DEN病毒的靶細胞受體為HS,且HS的硫酸化對E蛋白與受體的結(jié)合是必需的。將Vero細胞培養(yǎng)在含氯酸鈉(硫酸化抑制劑)的培養(yǎng)基中,此時細胞的存活性并不受影響,但細胞與E蛋白的結(jié)合被抑制?？扇苄缘母叨攘蛩峄疕S能87%拮抗DEN病毒的感染。通過對E蛋白與GAGs的結(jié)合序列進行預(yù)測(在富含堿性氨基酸的區(qū)域找出被轉(zhuǎn)角分開的某個區(qū)域,它們?nèi)魧显谝黄饎t認為是GAGs結(jié)合序列),得出E蛋白具2個GAGs結(jié)合區(qū):E284～310氨基酸,位于Ⅰ區(qū)側(cè)面及Ⅲ區(qū)的終端;E386～411氨基酸,位于Ⅲ區(qū)尾部,與前者的C端共同形成暴露在外的受體結(jié)合位點,Rey等認為DEN病毒E蛋白(281～423氨基酸)具有潛在的靶細胞結(jié)合活性。由于各種細胞來源的HS呈現(xiàn)高度的異質(zhì)性,表現(xiàn)在一級結(jié)構(gòu)及硫酸化水平的差異,對DEN病毒選擇性組織親嗜性也許可以如下解釋:高硫酸化的HS能促進E蛋白的結(jié)合與感染,而低硫酸化的HS抑制E蛋白與細胞的結(jié)合。但近來的研究表明DEN病毒的穿入也許還需要其他高親和力受體存在,如單純性皰疹病毒Ⅰ型感染成纖維細胞時,其特異性受體為生長因子受體,而HS則作為一個輔助分子起作用。以上研究均是在非人細胞系上進行的。對兩株與DEN-2高度親和的人白細胞系(髓單核細胞系HL60及非EBV轉(zhuǎn)化的B細胞系BM13674)的研究也表明GAGs參與病毒-細胞間的相互作用,但不可能是唯一方式。Bielefeldt-Ohmann認為肝素是高度帶電分子,它抑制DEN-2與細胞的結(jié)合可能是通過非特異性干擾VAP-細胞受體的相互作用而實現(xiàn)的。目前較為合理的解釋是HS使登革病毒粘附至細胞上,粘附作用的增強還需要特異性高親和力受體存在,并最終介導(dǎo)登革病毒進入細胞。登革病毒的另一類受體為病毒特異性IgG及IgM類抗體,抗體分子雖然不是細胞膜表面結(jié)構(gòu),但仍可作為一類十分特殊的病毒受體介導(dǎo)病毒的吸附和穿入。通常人及靈長類動物的單核巨噬細胞雖可感染DEN,但細胞只能有限度地支持病毒的繁殖。如在細胞培養(yǎng)過程中加入亞中和濃度的抗DEN單克隆抗體,可導(dǎo)致病毒的大量復(fù)制,通常病毒產(chǎn)量可增加20～1000倍,這種現(xiàn)象稱為抗體依賴性增強作用(ADE)。其基本原理是:抗體的Fab段與病毒特異結(jié)合,而抗體的Fc段則與細胞表面的FcR結(jié)合,形成病毒-抗體-細胞復(fù)合體,從而介導(dǎo)病毒的感染,當(dāng)然,ADE作用并不是登革病毒獨有的,幾乎所有的抗病毒表面抗原表位的抗體均有不同程度的ADE作用,其發(fā)生依賴于感染細胞表面存在的FcR。此外,補體受體(C3R)也能引起登革病毒感染增強作用。2病毒rna的形成DEN病毒的復(fù)制過程發(fā)生在感染細胞胞漿,正鏈RNA合成的循環(huán)模板是復(fù)制型(RF)RNA,為雙鏈RNA(dsRNA),在病毒復(fù)制周期中正鏈RNA大約是負鏈RNA的10～100倍。在DEN-2病毒感染細胞中可觀察到病毒誘生的膜結(jié)構(gòu)。通過免疫金標(biāo)記及一系列的生化分析表明KUN病毒感染Vero細胞后,能誘生一系列獨特的膜結(jié)構(gòu),病毒的復(fù)制復(fù)合體(replicationcomplex,RC)存在于膜泡群(vesiclepackets,VP),由dsRNA及NS1、NS2A、NS3、NS4A與NS5蛋白組成,此外,特異的細胞蛋白(如eF1-α可與3′NTR端的SL結(jié)構(gòu)相互作用)也可能參與病毒的復(fù)制過程。黃病毒誘生的膜結(jié)構(gòu)雖然早有報道,但長期以來對這些膜的細胞內(nèi)起源及其在感染中所起的作用并不了解。最近采用免疫熒光及冷凍免疫電鏡技術(shù)顯示NS2B及NS3(病毒蛋白酶復(fù)合體)與NS4A共定位于誘生的卷曲膜(convolutedmembranes,CM)及次晶態(tài)排列(paracrystallinearrays,PC),而復(fù)制復(fù)合體定位于VP。其他蛋白如C蛋白及NS4B則與增殖的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相連,然后再轉(zhuǎn)位至胞核。進一步對KUN病毒感染后的膜形成動力學(xué)進行研究,發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在膜成分的重排,包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)、中間腔(intermediatecompartment,IC)及反式高爾基體的膜成分。重排或誘生的結(jié)構(gòu)具物理上的連接,并且在病毒復(fù)制周期中有各自明確的功能。正鏈RNA的翻譯發(fā)生在RER,首先產(chǎn)生多聚蛋白前體,隨后在ER腔進行信號肽的切割,CM及PC膜結(jié)構(gòu)中存在的NS2B/NS3蛋白酶對大部分NS區(qū)蛋白的切割產(chǎn)生單個的NS蛋白,它們可仍然滯留于CM/PC(如NS2B、NS3及NS4A)內(nèi),也可進一步轉(zhuǎn)運至VP(如NS1、NS3、NS5、NS2A及NS4A),或者移至胞核(NS4B)。病毒蛋白從RER向高爾基體的運動對膜的誘生是必需的,CM膜與PC膜可相互轉(zhuǎn)換,它們均來自IC,而VP膜則誘生于反式高爾基體的膜成分。位于VP膜內(nèi)的復(fù)制復(fù)合體又是如何形成并啟動負鏈RNA的合成呢?這方面的研究得益于穩(wěn)定的KUN感染性全長cDNA克隆FLSDX的建立及能永久表達KUN病毒復(fù)制子RNA的BHK細胞系repBHK的建立,前者使突變基因的引入變得容易,后者則有利于反式互補作用的研究。KUN病毒復(fù)制子RNA為缺失了病毒的大部分結(jié)構(gòu)區(qū)基因(僅保留了C蛋白的前60個核苷酸)的亞基因組RNA,能在轉(zhuǎn)染細胞中復(fù)制,這說明RNA的復(fù)制只需NS蛋白即可。對黃病毒NS1蛋白亞細胞定位顯示大部分NS1緊密結(jié)合在病毒誘生的VP膜上,Muglaert等進一步證實了YFV-NS1溫度敏感突變株能阻斷其基因組RNA的擴增。黃病毒NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶(serineprotease)活性及核苷三磷酸酶活性(nucleosidetriphosphatase,NTPase)、RNA解旋酶活性(RNAhelicase),前者的功能結(jié)構(gòu)域位于NS3蛋白N端的1/3區(qū),主要負責(zé)多聚蛋白的翻譯后加工,產(chǎn)生成熟的病毒蛋白,這是病毒自我復(fù)制和組裝的前提條件;后者的功能域位于C端的2/3區(qū),主要參與病毒RNA的復(fù)制過程。黃病毒NS5蛋白具有非特異性RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性,包括8個保守的RdRp序列,其中之一為GDD序列(Gly-Asp-Asp),另有2個保守的具甲基轉(zhuǎn)移酶特性的MT序列,在全長cDNA克隆FLSDX中分別缺失GDD序列和一個MT序列(S-腺苷甲硫氨酸位點),產(chǎn)生FLdGDD、FldSAM構(gòu)建體,將它們的體外轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)入BHK細胞,結(jié)果這些RNAs完全失去復(fù)制能力,可見GDD序列及MT序列對NS5功能的發(fā)揮是必不可少的。如果將它們的體外轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)入repBHK細胞,則可產(chǎn)生僅能在repBHK細胞中復(fù)制的缺失病毒。這是因為repBHK細胞內(nèi)能穩(wěn)定產(chǎn)生輔助復(fù)制復(fù)合體,缺失GDD及MT序列形成的缺失型復(fù)制復(fù)合體能與輔助復(fù)制復(fù)合體有效地交換成分,其中的輔助NS5可結(jié)合至缺失RNA模板啟動復(fù)制。通過對KUN病毒NS5基因的進一步缺失研究表明,將感染性全長cDNA克隆NS5基因羧基端5%、34%、56%的區(qū)域缺失后,體外轉(zhuǎn)染repBHK細胞,均有缺陷病毒分泌,其中將NS5基因羧基端缺失56%的構(gòu)建體缺失了全部的RdRp區(qū)。而將缺失NS5基因氨基端的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染repBHK細胞后,NS5的功能不能被有效互補。通過比較黃病毒NS5蛋白N端的氨基酸序列,找到了3個高度保守區(qū):a區(qū)(141～151氨基酸),b區(qū)(203～223氨基酸),c區(qū)(343～365氨基酸),這3區(qū)缺失的RNA不能在repBHK細胞復(fù)制。由此可以設(shè)計一個這樣的復(fù)制模型(圖1,2):在翻譯過程中,黃病毒NS5蛋白的N端通過保守序列(a區(qū)、b區(qū)、c區(qū))與NS3和NS2A相互作用,于基因組RNA的3′NTR啟動復(fù)制復(fù)合體的形成。然后RNA模板與已形成的不成熟復(fù)制復(fù)合體運輸至VP膜上某個錨定區(qū),以形成完整的復(fù)制復(fù)合體,并在此處啟動負鏈RNA的合成。復(fù)制復(fù)合體一旦形成即以活性狀態(tài)穩(wěn)定存在,不需要新翻譯的NS蛋白的補充。NS2A的作用可能是將病毒的RNA及復(fù)制復(fù)合體靶向VP膜,NS4A是一個跨膜蛋白,以二聚體形式存在,NS1與NS4A的腔內(nèi)部分直接結(jié)合,可誘導(dǎo)NS4A的構(gòu)象發(fā)生變化,然后NS4A及NS2A通過疏水相互作用結(jié)合,形成的完整復(fù)制復(fù)合體發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,使其中NS5的RdRp區(qū)與正鏈RNA結(jié)合,啟動負鏈RNA的合成。根據(jù)上述推測的復(fù)制模型可以看出,缺失NS5蛋白的C端并不阻止它與其他NS蛋白的相互作用,但最終形成的是缺陷型復(fù)制復(fù)合體。通過互補實驗發(fā)現(xiàn)缺陷型復(fù)制復(fù)合體仍能將缺失了NS5基因C端的RNA運送至repBHK細胞內(nèi)輔助復(fù)制復(fù)合體合成位點,此過程可能由NS2A引導(dǎo)。缺陷型復(fù)制復(fù)合體通過與輔助復(fù)制復(fù)合體或其中成分交換,從而啟動缺失了NS5基因C端的負鏈RNA合成。該模型是否真實反映了黃病毒的復(fù)制事件尚需進一步的實驗證實。3檢查病毒幾何質(zhì)量及重組病毒顆粒DEN病毒的核衣殼由衣殼蛋白C及基因組RNA構(gòu)成,其中C蛋白含大量的Lys和Arg殘基,這些堿性氨基酸可部分中和RNA的負電荷。使用DEN-2及DEN-4衣殼蛋白C的單克隆抗體可檢測到C蛋白存在于感染細胞的胞漿、胞核膜及核內(nèi),目前對C蛋白具有的核定位位點重要性及其與病毒形態(tài)發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。DEN病毒組裝的第一步發(fā)生在ER膜相關(guān)位置。C及PrM蛋白連接處的內(nèi)部信號序列指導(dǎo)prM蛋白穿越ER膜并定位于ER腔。NS2B/NS3催化C蛋白羧基端在胞漿側(cè)的切割,此過程使以隱蔽構(gòu)象存在的prM信號肽在轉(zhuǎn)位通道前后作布朗運動,然后被位于ER膜腔側(cè)的信號肽酶識別。同樣prM-E連接處的切割也由ER內(nèi)的信號肽酶介導(dǎo)。如果將prM信號肽的羧基端用理想的信號肽酶識別序列VPQAQA取代,可使C-prM連接處無需先經(jīng)NS2B/NS3在胞漿切割,信號肽酶即可發(fā)揮作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)信號肽酶對prM的切割功能的確加強了,同時感染性病毒顆粒的產(chǎn)量也大大降低。進一步研究表明,VPQAQA突變體并不影響病毒復(fù)制的早期過程(病毒RNA及蛋白質(zhì)合成),可能影響的是發(fā)生在ER膜上黃病毒的組裝。該突變體導(dǎo)致C蛋白以膜錨定形式存在,可能它不能作為NS2B/NS3的底物,這對病毒的組裝影響極大,因為錨定蛋白是病毒粒子C蛋白的前體,前者向后者的轉(zhuǎn)換可啟動核衣殼在胞漿的組裝。DEN病毒粒子組裝的第二步是形成一個未成熟顆粒,E蛋白與prM蛋白非共價相連成異源二聚體,其中prM起伴侶分子的作用,可阻止未成熟病毒顆粒在通過酸性膜泡分泌過程中,E蛋白構(gòu)象發(fā)生不可逆變化。隨后prM蛋白內(nèi)部,受宿主弗林蛋白酶(furin)的切割,裂解產(chǎn)生M蛋白,引發(fā)病毒顆粒表面的E蛋白形成同源二聚體,最終產(chǎn)生成熟的病毒顆粒。只有含M蛋白的病毒顆粒才能介導(dǎo)病毒與細胞間在酸性pH條件下的融合。初步認為登革病毒顆粒組裝過程如下:在蛋白合成過程中E、prM插入RER膜;C蛋白與病毒的RNA在胞漿中裝配成核衣殼,并集中于ER膜的細胞漿側(cè)。核衣殼可能通過芽生方式獲得包膜,非成熟病毒顆粒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組裝,然后進一步轉(zhuǎn)運到反式高爾基體,對E蛋白及prM蛋白的糖側(cè)鏈進行加工,通過細胞分泌途徑運輸至胞外。在釋放前,prM裂解產(chǎn)生M蛋白,E蛋白同源二聚體化形成成熟的病毒顆粒。登革病毒prM、E蛋白糖側(cè)鏈的加工對病毒糖蛋白的正確折疊有重要意義。DEN-