丹紅注射液對大鼠動脈血管擴張作用及其機制研究

丹參紅注射液以丹參和紅花為主要成分，采用現代工藝科學制備的復方制劑。主要療效包括丹參酮、丹參酸、丹參酚酸、紅景天、紅花酚酸、兒茶酚等。血液擴散、舒脈、舒絡脈象。臨床上將其應用于動脈粥樣硬化、心肌梗死等心腦血管疾病的治療,可以明顯緩解臟器組織供血不足、改善血液流變學指標。然而,目前對于丹紅注射液治療作用的研究多為臨床資料,對于丹紅注射液發揮臨床治療效果的藥理學基礎則知之不多。因此,本研究擬以大鼠在體后肢灌流模型和離體大鼠腹主動脈環為模型,觀察丹紅注射液舒張血管的作用及其機制,為丹紅注射液治療微循環等疾病提供理論參考。1材料表面1.1大器、張力換能器PowerLab數據記錄和分析系統,包括軟件Chart510以及硬件8通道橋式放大器(ADInstrumentsCo.,Australia);FT03C張力換能器(GrassInstrumentCoQuincy,Mass,USA);Myograp恒溫浴漕(DMT,Denmark);體視顯微鏡(NikonSMZ-1500)。1.2甲磺酸酚妥拉明注射液丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司,批號090114,規格:10mL/支);重酒石酸去甲腎上腺素注射液(NE,上海禾豐制藥有限公司,批號100302,規格:2mg∶1mL);甲磺酸酚妥拉明注射液(上海旭東海普藥業有限公司,批號100601,規格:10mg∶1mL);阿托品(天津藥業,批號1002271,規格:0.5mg∶1mL);咖啡因(caffeine,熔點標準品,陜西省藥品檢驗所饋贈);四氨基吡啶(4-Ap)(Sigma公司,批號A3858)和四乙胺(TEA)(Sigma公司,批號akeasci96203)。1.3體質量與動物Sprague-Dawly(SD)大鼠80只,體質量(180～220)g,♀♂兼用,由西安交通大學實驗動物中心提供,合格證:SCXK(陜)2007-001號。2方法和結果2.1統計方法實驗數據除特殊標注外,其余均以xˉ±sxˉ±s表示,組間均數的兩兩比較采用t檢驗。2.2灌流液體積測定將烏拉坦(1g·kg-1,ip)麻醉的大鼠置于實驗臺固定,沿腹部正中切開,分離腹主動脈與靜脈,在腎血管水平向遠心端插管,并結扎近心端。腹主動脈插管灌注37℃氧飽和的Krebs灌流液,調節灌流壓至50mmHg,平衡0.5h后,依次用含有不同濃度藥物的灌流液灌流,經腹主靜脈插管回收灌流液,測定單位時間內回收灌流液的體積。更換藥物前,均用空白灌流液平衡灌流0.5h,使灌流速度恢復至用藥前水平。以空白灌流液平衡狀態下的灌流速度作為100%,計算在同一標本上藥物灌流時的相對流速。相對流速=含藥灌流液灌流流速/空白灌流液灌流流速×100%2.2.1統計學意義:“0.0.052.5”5在體灌流試驗結果顯示,陽性對照藥1×10-5mol·L-1阿托品可增加大鼠后肢血管灌流速度174%,具有非常顯著的統計學意義(P≤0.05);丹紅注射液在灌流量0.1,0.3,1.0,3.0mL·L-1時,平均相對灌流速度增加最大未超過10%,均無統計學意義,僅在高灌流量(30mL·L-1)時對平均相對灌流速度增加了33%,具有統計學意義(P≤0.05)。2.2.2krebs液沖洗前后高鉀預收縮血管速度比較以Krebs液沖洗平衡標本,再用含30mmol·L-1KCl的Krebs液灌流40min,使血管預收縮至穩定狀態,隨后觀察在高鉀條件下,不同濃度丹紅注射液對灌流速度的影響。結果顯示,在正常Krebs液沖洗平衡的標本中加入KCl后,灌流速度有明顯降低,平均相對流速降低到正常灌流的48%(P≤0.01);陽性對照藥異丙腎上腺素(1×10-5mol·L-1)可使高鉀預收縮的血管平均相對灌流速度提高80%,顯著對抗高鉀所引起的灌流速度降低(P≤0.01)。0.3,1.0,3.0mL·L-1丹紅注射液可使平均相對灌流速度分別提高到115%,112%和127%,但僅3.0mL·L-1流量組與高K+組模型對照組差異具有統計學意義(P≤0.05)。2.2.3l-4丹紅注射液的抗菌材料如表1所示,對于NE所引起的大鼠后肢灌流速度明顯降低,0.3～3mL·L-1流量的丹紅注射液均表現出了顯著的拮抗效果(P≤0.05)。2.3丹紅注射液及kras對大鼠腹主動脈血管的張力及相關效應的變化大鼠斷頭處死后迅速取出動脈血管,浸入冷Krebs液中在顯微鏡下剝離血管周圍組織。以Ach(1×10-5mol·L-1)檢驗內皮功能,若舒張率>75%則表明內皮完整,舒張率<10%則顯示內皮已被完全去除。用于去內皮試驗的血管標本在實驗前用0.1%的TrintonX-100灌注5s,然后再用Krebs液灌注10s。將處理好的血管剪成1mm長的動脈環,套在2個L型的金屬針上,一端連接FT03C張力換能器,另一端連接調節負荷張力的微調裝置,并將連接好的動脈環置于37℃恒溫氧飽和的Krebs灌流液中。實驗前,調節動脈環靜息負荷至2mg·L-1,每2分鐘換液1次,穩定1.5h。以K+-Krebs液(含60mmol·L-1K+)檢驗動脈環收縮性,2次收縮幅度變化小于10%的標本用于實驗。用四乙胺(TEA)或四氨基吡啶(4-Ap)預孵育0.5h后,以NE(1×10-6mol·L-1)預收縮血管,收縮穩定后累加濃度法加入丹紅注射液或等體積灌流液,對比觀察藥物的作用。標本平衡灌流待基線穩定后,濃度累加法加入丹紅注射液或Krebs液平行操作,觀察在0.3,1.0,3.0,10,20,30,40mL·L-1系列濃度下丹紅注射液對正常大鼠腹主動脈血管環基礎張力的影響。結果顯示,在3～40mL·L-1范圍內,丹紅注射液舒張血管作用表現出統計學意義(P<0.05),但血管平均張力降低幅度與空白對照組相比均不超過12%,表明其對正常血管的張力幅度影響較小。以1×10-6mol·L-1濃度NE預收縮血管,穩定后濃度累加法加入丹紅注射液或空白對照Krebs液。如圖1所示,在觀察的0.3～40mL·L-1范圍內,丹紅注射液可濃度依賴性地舒張NE預收縮含內皮(P<0.01)和去內皮(P<0.01)的血管環。雖然內皮完整的主動脈環的舒張效應與去內皮血管環的舒張效應之間未發現有顯著性差異(P>0.05),但相對于各自的空白對照組,在3～40mL·L-1下,2組相對張力降低的幅度之間存在明顯性差異(P<0.05)(見圖2)。其中:相對張力降低的幅度=給藥組相對張力-對照組相對張力。上述結果表明,丹紅注射液對腹主動脈血管環的舒張除通過平滑肌起作用外,內皮細胞也發揮一定的作用。內皮完整的腹主動脈血管環,穩定灌流1.5h,加入KCl(終濃度60mmol·L-1)穩定40min后,累積法依次加入丹紅注射液或空白對照Krebs液。如圖3所示,丹紅注射液可舒張KCl預收縮的血管環,且呈濃度依賴性(P≤0.01)。腹主動脈環平衡灌流1.5h后,用K+(60mmol·L-1)檢驗血管活性,合格后分別以四乙胺(TEA)1×10-3mol·L-1或四氨基吡啶(4-Ap)1×10-4mol·L-1預孵育內皮完整的腹主動脈環0.5h,加入1×10-6mol·L-1濃度NE預收縮大鼠腹主動脈,穩定后按濃度梯度法加入丹紅注射液或空白對照Krebs液,對比觀察丹紅注射液的血管舒張效應。計算相對張力降低幅度。相對張力降低幅度=對照組相對張力值(%)-丹紅組相對張力值(%)結果如圖4和圖5所示,無論鉀離子通道阻滯劑TEA或4-Ap存在與否,NE對腹主動脈的收縮作用均無明顯變化,顯示TEA和4-Ap對NE收縮腹主動脈的作用均無明顯影響。在TEA或4-Ap存在下,與空白對照組相比,丹紅注射液均可顯著性拮抗NE引起的血管收縮(P<0.01);TEA和4-Ap對丹紅注射液引起的血管舒張的相對張力降低幅度均無明顯影響(P>0.05)。因此,在腹主動脈上鉀離子通道阻滯劑TEA和4-Ap對丹紅注射液拮抗高NE血管收縮的作用均無明顯影響,提示在腹主動脈上丹紅注射液舒張血管的作用可能與鉀離子通道無關。內皮完整的腹主動脈血管環,平衡1.5h后,用無鈣Krebs液(正常Krebs液中無CaCl2并加入Ca2+絡合劑1×10-4mol·L-1EDTA)孵育5min,以此作為無鈣灌流平衡張力100%,然后加入1×10-6mol·L-1的NE,可見動脈環產生迅速而短暫的收縮,計算相對張力;繼續灌流待張力平穩,作為后續復鈣灌流的100%,加入1×10-3mol·L-1的CaCl2,可見動脈環再次收縮并達峰值,計算復鈣灌流的相對張力。然后用Krebs液反復沖洗5次,平衡45min,加入無鈣的Krebs液的同時加入20mL·L-1的丹紅注射液作用5min,重復上述實驗。觀察丹紅注射液對無鈣Krebs液中NE或CaCl2縮血管效應的影響。結果如表2所示,在無鈣灌流條件下,丹紅注射液對血管平滑肌收縮的抑制作用較弱,顯示其對平滑肌細胞內鈣釋放影響較小;含鈣灌流液復灌后,丹紅注射液對動脈血管收縮的抑制作用較強,且具有非常顯著性統計學意義(P<0.001),提示丹紅注射液的血管舒張作用可能主要與阻滯外鈣內流有關。內皮完整的腹主動脈血管環,于無鈣Krebs液中平衡,以此張力作為100%。于無鈣Krebs液中加入30mmol·L-1咖啡因,可見動脈環產生迅速而短暫的收縮,計算相對張力。再在無鈣Krebs液中加入20mL·L-1丹紅注射液,重復上述實驗。結果顯示,咖啡因引起空白對照組和丹紅組血管環收縮的相對張力分別為(129±10)%和(146±21)%,兩者間并無統計學意義(P>0.05)。3丹紅注射液的血管擴張作用本次研究結果發現,丹紅注射液對正常灌流條件下大鼠在體血管流量和高濃度鉀離子引起大鼠組織血管流量減少的影響較小,僅在較高濃度下對大鼠后肢灌流有輕度的增加作用;對高NE引起的大鼠組織灌流減少有非常顯著的拮抗作用;可明顯舒張由NE收縮的在體血管直徑。交感神經興奮和循環血液中的高兒茶酚胺狀態既是引起組織血液灌流減少和微循環障礙的重要原因之一,也是中醫上“血淤”發生的重要的病理學基礎。因此,這一觀察結果提示,拮抗高NE的縮血管效應可能是丹紅注射液改善組織血流供應和微循環以及發揮“活血化淤”功效的重要途徑。為探討丹紅注射液舒張血管的作用機制,本研究選擇了較大的腹主動脈作為觀察對象,采用大鼠離體腹主動脈環研究模型。結果發現,無論是內皮完整的還是去內皮的血管環,丹紅注射液都可以拮抗NE引起的血管收縮,其中內皮完整血管的舒張幅度稍高于去內皮血管,從而提示丹紅注射液的舒張血管作用部分可能通過內皮細胞發揮作用。KCl可以激活電壓依賴性鈣通道,導致細胞外鈣內流而引起動脈環收縮。丹紅注射液能夠舒張KCl預收縮的動脈環,提示丹紅注射液可通過抑制電壓依賴性鈣通道,阻止鈣內流而起到舒張血管的作用。鉀離子通道阻滯劑TEA和4-Ap對丹紅注射液拮抗高NE收縮血管的作用均無明顯影響,提示丹紅注射液擴張血管作用與其影響鉀通道關系不大。NE和咖啡因均為平滑肌鈣通道研究的工具藥物。在無鈣液灌流條件下,NE和咖啡因均可通過促進平滑肌細胞內Ca2+釋放而引起血管快速而短暫的收縮;在含鈣液灌流條件下,NE能夠通過激活細胞膜上的受體操縱鈣通道增強外鈣內流,誘發血管收縮。細胞內Ca2+釋放通過IP3和Ryanodine2種受體–Ca2+釋放途徑。本次實驗發現,丹紅注射液對于無鈣灌流條件下咖啡因引起的動脈血管平滑肌收縮的抑制作用影響較小或未見有抑制作用,提示丹紅注射液發揮作用主要通過抑制IP3受體中介的鈣釋放,而對Ryanodine受體途徑沒有影響。對于無鈣灌流條件下NE引起的動脈血管平滑肌收縮的抑制作用在腹主動脈上未見明顯影響;對含鈣灌流條件下NE誘發血管收縮有顯著的抑制作用,從而提示丹紅注射液可能主要通過抑制經受體操縱鈣通道的外鈣內流發揮血管舒張作用。綜上所述,丹紅注射液對高NE引起的大鼠組織血液灌注減少和微循環降低有明顯的改善作用;丹紅注射液可拮抗高NE和高鉀(其中主要是高NE)所引起的血管平滑肌收縮;內皮細胞在丹紅注射液的血管舒張作用中發揮一定作