登革病毒病的診斷與防治

病毒登格病毒（dad）是黃病毒屬的一種單帶正鏈rna病毒。在5c-pm模式下，編碼了三種結構蛋白和七種非結構蛋白。從5c-iiic-prm（m）-e-ns1-ns2a-ns3-ns4a-ns5-3。根據E蛋白的抗原性不同,它分為4個血清型(DV1~4)。DV主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播,引起人類登革熱(classicaldenguefever,DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(denguehaemorrhagicfever/dengueshocksyndrome,DHF/DSS)。對DF的發病癥狀早在18世紀就有記載,但在相當長的時間里人們并不了解其病因及流行來源。幾個世紀以來,世界各地陸續有此病流行的報道,但真正分離到病毒還是在20世紀40年代。自上個世紀80年代以來,DF和DHF/DSS在世界范圍的流行及暴發更加頻繁。我國自1978年以來,在沿海地區如廣東、廣西、海南、福建、臺灣等地均暴發過DF及DHF/DSS。據報道,DV每年感染約1億人,其中DHF/DSS患者約有50萬人,病死率為5%~10%,如未及時治療,可上升至50%。近年來,在我國南方及東南亞,DHF/DSS的發病率有明顯增加之趨勢,已成為嚴重的公共衛生問題。然而,由于DV有4個血清型,且目前尚無理想的疫苗問世,預防仍主要依賴于對蚊媒的控制。因此,闡明DV進入靶細胞的分子機制及致病機制,從中尋找有效的防治方法是當今迫切需要解決的問題。靶細胞上DV特異性受體的研究是近幾年關注的熱點,現就此作一綜述。病毒受體概念病毒受體是宿主基因組編碼、控制和表達的一組蛋白質,它參與病毒與靶細胞的相互作用,使病毒吸附在細胞表面。在病毒受體的介導下,病毒最終進入細胞進行復制。細胞上的病毒受體的特異性決定了病毒的宿主范圍和組織親嗜性。過去認為病毒與細胞的相互作用是通過病毒的某個成分——病毒吸附蛋白(virusattachmentprotein,VAP)直接識別或結合到細胞表面的單個分子上。近年來相繼分離出了多種病毒的受體,同時在病毒受體的本質及病毒和受體相互作用機制等研究方面也取得了很大的進展。目前認為,病毒與受體的結合是一個多步驟過程,涉及不同的病毒吸附蛋白及多個靶細胞受體。細胞表面的病毒受體可以是特異性的,也可以是非特異性的;病毒可能與一個以上的細胞表面分子結合,且同一病毒與不同細胞所結合的受體可能不同。DV包膜E蛋白病毒對細胞的嗜性與VAP結合特異性細胞受體的能力有關,E蛋白是DV的結構蛋白,位于DV的表面,有494個氨基酸及2個潛在的糖基化位點,是病毒顆粒的主要包膜蛋白。登革病毒感染的早期現象是病毒的吸附及穿入,而E蛋白對這些過程均有影響,并能影響病毒毒力和細胞嗜性,其序列中第98~111位的氨基酸構成了一個與融合及變構相關的結構域,因而被認為是登革病毒的VAP。此外,它有與中和抗體及血凝素抑制抗體反應的抗原決定簇,同時具有型特異性抗原決定簇。Modis等通過對DV2型E蛋白晶體結構的研究認為,E蛋白的三維結構如下:E蛋白以延伸的二聚體形式平鋪在病毒表面,折疊成3個不同的區域,Ⅰ區是一個β桶狀中心結構,由氨基端及羧基端序列產生;Ⅱ區形成一個延伸的指狀結構,可能與E蛋白二聚體的形成及膜融合過程相關;Ⅲ區為IgG免疫球蛋白樣折疊,可能存在一個三角形的受體結合環,因而在病毒與宿主細胞之間相互作用中發揮著重要的功能。同時,DV與特異性細胞受體的結合依賴于E蛋白的二聚體結構,在低pH值的條件下,E蛋白的構像發生改變,由二聚體形成三聚體,隨后病毒包膜與細胞膜融合,進而促進DV對細胞的感染。此外,Modis等通過晶體結構的研究還認為,登革病毒E蛋白存在一個配體結合“口袋”,結合疏水的配體,它影響在低pH值條件下,E蛋白發生變構介導膜融合的過程,其作用的發揮通過Ⅰ、Ⅱ區結合面的一個發卡結構來控制配體結合“口袋”的開合,當配體結合“口袋”打開時,與膜融合相關的結構域暴露在外,反之則相反。因而可以利用這一點設計一個小分子物質與配體結合“口袋”結合,阻止E蛋白發生變構,使膜融合不能發生。DV受體有關DV病毒受體的研究剛剛起步,目前認為DV受體包括糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)、與脂多糖連接的CD14相關分子等,研究大都采用體外傳代的細胞系及病毒重疊蛋白結合測定法(virusoverlayproteinbindingassay,VOPBA),測定病毒是否結合到所分離的蛋白上。1.dv2和行激素2在細胞表面功能的互動關系探討糖胺聚糖是由二糖重復單位(氨基己糖、己糖醛酸或半乳糖)組成的線性雜多糖,其重復二糖骨架的化學結構,廣泛存在于細胞膜和細胞外基質。GAGs由細胞合成后分泌到細胞外,并能與細胞膜上的細胞外基質受體結合。實際上細胞外基質是細胞分泌物在細胞附近構成的精密網絡。組成GAGs的二糖單元中有一個糖殘基必定是氨基糖,即N-乙酰葡糖氨或乙酰半乳糖胺,氨基糖大都硫酸化,另一個糖殘基多為糖醛酸。根據糖殘基的性質、連接方式、硫酸基的數量和存在的部位,GAGs一般可分為四類:透明質酸(HA)、硫酸軟骨素(CS)/硫酸皮膚素(DS)、硫酸角質素(KS)及硫酸乙酰肝素(HS)/肝素。GAGs可與蛋白質共價結合,形成蛋白聚糖,其功能由核心蛋白和GAGs的性質決定。核心蛋白穿越脂質雙層或通過葡糖磷脂酰肌醇與脂質雙層結合。如成纖維細胞和上皮細胞的質膜中一種稱為聯合素的蛋白聚糖,它與整合素一樣,是細胞外基質的受體蛋白,其核心蛋白穿膜,細胞外區連有HS,細胞內區與皮層中的肌動蛋白絲相接。因此推測質膜中的蛋白聚糖的一個重要功能就是作為細胞表面的輔受體,與細胞表面的適當受體協作,參與某一生理或病理過程。Chen等及Rostand等經過研究DV2與Vero細胞之間的相互作用,認為DV與表達在基質及細胞膜上的GAGs的結合介導了病毒的吸附,同時通過對E蛋白與GAGs的結合序列進行預測(在富含堿性氨基酸的區域找出被轉角分開的某個區域,它們若對合在一起則認為是GAGs結合序列),得出結論為,E蛋白具有2個GAGs結合區:E284~310氨基酸,位于Ⅰ區側面及Ⅲ區的終端;E386~411氨基酸,位于Ⅲ區尾部,與前者的C端共同形成暴露在外的受體結合位點。Germi等證明用GAG——裂解酶除去Vero細胞的GAGs后,DV2與細胞的結合率降低,同時用DV2結合GAG表達缺陷的兩株CHO細胞發現,細胞株psgb168(半乳糖基轉移酶1缺陷,硫酸軟骨素合成障礙)和細胞株psgd677(硫酸乙酰肝素表達缺陷,但其余的GAGs表達增高)與DV2的結合率,均比野生型下降了75%以上。Bielefeldt-Ohmann同時對兩株與DV2高度親和的人白細胞株(髓單核細胞系HL60及非EBV轉化的B細胞株BM13674)的研究也得到相似結果。目前認為,GAGs參與DV與靶細胞的相互作用,但可能不是唯一方式,換言之,GAGs不是DV感染細胞所必需的,還有其他因素的參與。2.dv與hs的關系硫酸乙酰肝素(HS)是GAGs的一種,因在DV吸附和進入靶細胞過程中起重要作用而受關注。HS是一種高度硫酸化的氨基葡聚糖,一級結構為重復的二糖單位,雙糖中的殘基可形成硫酸酯,廣泛存在于細胞表面及細胞基質。Germi等發現,用含氯酸鈉(硫酸化抑制劑)的培養基培養Vero細胞,細胞的存活并不受影響,但細胞與E蛋白的結合被抑制,抑制率可達80%,據此認為,HS是DV受體,且HS的硫酸化對E蛋白與受體的結合是必需的。此外,因為肝素與HS同源,兩者的糖基相似,研究大都利用肝素來分析HS的作用。Hilgard等用500μg/ml肝素預處理DV1,可抑制病毒與人肝癌細胞株HuH-7的結合,拮抗率達75%;同時實驗還證明,DV吸附和進入肝細胞可能是通過其細胞表面的相對分子質量為33×103和37×103兩種與HS相連的蛋白聚糖,而DV的表面可能有HS的結合位點。Germi等將Vero細胞用肝素裂解酶1(對HS和肝素高度硫酸化的結構域有特異性作用)和軟骨素ABC裂解酶(對軟骨素和硫酸軟骨素起作用)在37℃處理1h,肝素裂解酶處理組顯著抑制了病毒的感染,肝素濃度越高,病毒結合率越低,拮抗率可達60%~70%,肝素的半數抑制劑量(ID50)為0.2μg/ml。Lin等通過實驗也證明,肝素可抑制DV2對5種人肝細胞系細胞株(HuH-7、HA22T、Hep3B、PLC、Changliver)的感染作用。另外Martinez-Barragan等發現,Vero細胞上另一種糖蛋白也與DV的吸附有關,且這一途徑不受HS的影響,提示參與DV感染的膜蛋白可能不是單一的分子,可能有其他高親和的受體存在,且不同細胞發揮受體作用的分子可能不同。綜上所述,可以看出DV與HS之間的作用是復雜的、多因素的,與病毒株、細胞株、細胞的傳代數以及細胞表面HS的分布均有關系。目前較為合理的解釋是HS使DV粘附至細胞上,使得DV易與細胞表面高特異性和高親和力受體結合,并最終介導DV進入細胞。3.脂多糖受體的結構Chen等認為,單核細胞和巨噬細胞表面高度表達的CD14與DV的進入有關。CD14是一種糖蛋白,也是脂多糖的主要受體,它與葡萄糖磷脂酰肌醇相連,在單核細胞和巨噬細胞的質膜中高度表達。實驗證明,在感染DV前加入脂多糖能有效阻止病毒感染,可能是影響了病毒進入細胞這一過程;但在實驗中也發現,用單克隆抗體阻斷CD14后再加入脂多糖,并不能影響DV的感染。據此認為位于單核細胞和巨噬細胞表面的脂多糖受體由兩部分組成:與葡萄糖磷脂酰肌醇相連的CD14和目前未被證實的作為共受體的跨膜蛋白(見圖1)。在缺乏脂多糖的條件下,DV直接通過這種未知的受體進入細胞;在脂多糖存在的條件下,脂多糖與CD14和未知受體相連,從而阻止病毒進入;用抗CD14的單克隆抗體將其阻斷,使脂多糖不能與之相連,DV便可通過此種未知受體進入細胞。4.dv與fc受體的關系除上述受體外,目前通過感染對DV易感的靶細胞,利用VOPBA方法,初步推斷出一些DV受體分子。DV2受體分子包括:K562細胞表面的相對分子質量為100×103蛋白、白紋伊蚊C6/36細胞表面的相對分子質量為67×103和80×103蛋白、N1E-115(神經母細胞瘤細胞)和SK-N-SH(人神經母細胞瘤細胞)表面的一種對胰蛋白酶敏感的相對分子質量為65×103蛋白;DV4的受體分子包括:C6/36細胞表面的相對分子質量為40×103和45×103糖蛋白、Vero細胞表面的相對分子質量為74×103蛋白。但這些研究僅限于證明了可能作為受體的膜蛋白的相對分子質量,對于它的性質等還有待于進一步闡明。此外,單核-巨噬細胞表面的免疫球蛋白G(IgG)的Fc受體可能也是DV的受體之一。DV初次感染產生的非中和抗體或較低水平的中和抗體與二次感染的不同型別的DV,形成抗體-病毒復合物,通過IgG的Fc段與單核-巨噬細胞表面的Fc受體結合,促進病毒對細胞的感染并在其中大量增殖,同時激活CD4+和CD8+T細胞產生大量的細胞因子,造成炎癥反應加重,引起免疫病理損傷,導致DHF/DSS。研究證明,在大量DHF病例中可見TNF-α、IL-6等細胞因子的明顯升高,而TNF-α可進一步誘導IL-6、IL-8、IL-10等細胞因子的產生。這些促炎性細胞因子可引起趨化肽等釋放,還可使內皮細胞活化而導致血管通透性增加,以及血凝/纖溶系統功能障礙。這一學說解釋了DHF/DSS患者表現出的血小板減少及血液濃縮等現象,但不能解釋DV是如何感染血液中無DV抗體的人群,也不能說明DV是