異養硝化菌的篩選及特性研究

銨氮是我國污染的主要污染物，可引起水體富營養化。在25c下，中國將銨氮納入國家污染物總數控制體系，重點控制水體中的銨氮。異形硝化是微生物通過使用有機土壤、亞硝酸鹽和亞硝酸鹽轉化為異形硝酸。與傳統的自養硝化菌相比，異形硝化菌生長速度快、細胞產量高、溶解氧濃度低的優點。它有效地解決了傳統生物硝化處理的長期存在、條件嚴重性等問題。因此，近年來，異質硝化菌的研究和應用已成為國內外的熱點。本文從馴化后的活性污泥中分離、誘變出一株高效異養硝化菌,編號為JZ1-1.對該菌的硝化性能及其影響因素、遺傳穩定性進行研究,并由浙江省微生物研究所對其形態和生理生化特性進行分析鑒定,旨在為今后該菌的工程應用提供基礎數據.1材料和方法1.1菌株的分離與誘導1.1.1固體培養基C6H12O6·H2O5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.02g、C6H5Na3O7·2H2O1g、KH2PO44g、K2HPO46g、蒸餾水1000mL、pH7.0～7.2.向培養基中加入2%(W/V)瓊脂配成固體培養基.1.1.2誘導劑1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(日本東京仁成工業株式會社).1.1.3g、nh42so4.5g、mgso47h2oC6H5Na3O7·2H2O5.7g、(NH4)2SO40.5g、MgSO4·7H2O0.02g、K2HPO41g、加蒸餾水配制成1000mL.1.1.4菌種生物富集培養取100mL異養硝化培養基于250mL錐形瓶中,采用8層紗布加一層牛皮紙包扎瓶口,置于壓力蒸汽滅菌鍋中,0.1～0.15MPa120℃條件下滅菌30min.搖床培養時用8層紗布扎口.將分離純化后的菌株接種于滅菌后的培養基中,30℃150r·min-1條件下進行富集培養.至菌液渾濁,生長量達到對數期濃度,作為菌種懸浮液.1.1.5最佳菌株的確定取5mL馴化后的活性污泥于100mL經滅菌后的培養基中,30℃150r·min-1富集培養3d,并擴大培養3次.采用平板劃線進行分離,為保證所篩菌株的純度,重復平板劃線分離多次.將純化后的菌株以5%的接種量接入銨態氮模擬廢水中培養18h,測定其硝化性能.対硝化性能較好的幾株菌進行誘變.將其培養至對數期,離心,以磷酸緩沖液沖洗沉淀2～3次,制成菌懸液.調節菌液濃度為108CFU·mL-1.取2mL菌懸液,加入2mL濃度為1mg·mL-1的1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍溶液,充分搖勻,使其最終濃度為0.5mg·mL-1,并于150r·min-137℃下振蕩處理30min.離心,用磷酸緩沖液沖洗收集菌體,轉入液體培養基中,富集培養3d,后經平板劃線分離數次得到純菌,并測定其硝化性能,取硝化性能最佳的菌株作進一步試驗.1.2菌株生理生化試驗篩得誘變菌株送由浙江省微生物研究所進行鑒定.對該菌株進行革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察其形態.菌株生理生化試驗依據《常見細菌系統鑒定手冊》進行,測定項目包括葡萄糖、甘露醇、接觸酶、氧化酶、聚-β-羥基丁酸酯(PHB)積累、明膠液化、硝酸鹽還原、脲酶、乙酰甲基醇(V.P)、H2S、精氨酸雙水解酶.1.3銨態氮降解能力測試菌株活化后以5%的接種量接入銨態氮模擬廢水,于30℃150r·min-1條件下進行銨態氮降解能力測試,以不接種的模擬廢水作為空白對照,并對比廢水滅菌與不滅菌下菌株的硝化性能.銨態氮殘留量的測定采用納氏試劑分光光度法.1.3.1銨-氮分辨率的測定每隔3h測定一次銨態氮含量,繪制銨態氮降解曲線.1.3.2碳源型對植物硝化作用的影響分別以葡萄糖、碳酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、草酸鈉、酒石酸鉀鈉作碳源,保持其他成分不變.1.3.3c-n對植物硝化性能的影響試驗改變碳源檸檬酸鈉量,使廢水中C/N分別為4、6、8、10、12、14、16、18、20.1.3.4ph的影響和硝化作用中的ph值變化改變廢水pH為4、5、6、7、8、9、10、11.硝化過程中的pH值采用pH計測定.1.3.5溫度對蘑菇的硝化作用有影響分別調節搖床溫度為20、30、40和50℃.1.3.6溶解氧對植物硝化性能的影響試驗通過控制搖床轉速來調節培養液中的溶解氧濃度.分別調節搖床轉速為0、60、90、120、150和180r·min-1.1.3.7銨氮濃度對植物硝化性能的影響試驗分別調節廢水銨態氮濃度為50、100、200、300、400和500mg·L-1.1.4硝化性能測定將誘變所得目的菌株接入銨態氮模擬廢水中,于上述條件下測試菌株的硝化性能;采用轉接法從處理后的銨態氮廢水中抽取5%的菌液接入下一批銨態氮廢水進行繼代培養,并測定其中的銨態氮濃度.至第5代,考察菌株硝化性能的穩定程度,并以不接種的銨態氮模擬廢水作為對照.1.5數據可信的處理以上試驗均設置4個重復,平行樣結果偏差<0.5%則認為數據可信.所得結果剔除異常值后求均值,若4個重復中存在2個及2個以上異常,則重新進行試驗.采用Origin8.5軟件對試驗數據進行作圖.2結果與分析2.1菌株的分離、鑒定生理生化檢測結果表明,菌株JZ1-1為革蘭氏陰性菌,葡萄糖發酵產酸,甘露醇、接觸酶、明膠液化、硝酸鹽還原、脲酶、精氨酸雙水解酶試驗陽性,氧化酶、PHB積累、V.P、H2S試驗陰性.在光學顯微鏡下,菌體呈球狀,大小為0.5μm×1.0μm,單個、成雙或成短鏈排列,有莢膜,不運動.肉湯平板培養2d后形成的菌落呈乳白色、直徑約3mm、不透明、全緣、濕潤有光澤、粘稠、不產色素.其細胞顯微照片見圖1.根據菌株形態及生理生化特性,鑒定菌株JZ1-1為膠樣菌屬(Colloidessp.).2.2誘導反應后jz1-1的硝化性能2.2.1銨態氮降解情況反應前3h內,菌株處于調整期,銨態氮降解速率較低.之后菌株進入對數生長期,銨態氮降解迅速.至15h后,降解率達到100%,空白試驗銨態氮濃度基本無變化(圖2).故后續試驗將不再作額外說明.滅菌與不滅菌條件下的銨態氮降解效率相差在1.2%以內.2.2.2初始銨態氮濃度的影響碳源是微生物生長的重要能量源.不同的碳源由于分子結構的差異,微生物對它們的利用率不同.菌株JZ1-1碳源底物較寬,在有機碳與無機碳源上均能生長;對各種碳源均有一個短暫的適應過程.從圖3可見,反應4h,廢水中銨態氮濃度(初始銨態氮濃度皆為100mg·L-1)沒有發生明顯的變化;對檸檬酸鈉利用較好,其次為碳酸鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉,對草酸鈉利用最差,原因主要為高濃度草酸鈉溶于水中呈堿性,對菌株產生毒害作用.2.2.3c/n對碳源檸調整鈉/銨態氮降解的影響一定范圍內,C/N升高有利于硝化過程的進行.當C/N在4～14時,隨著C/N增大,菌株對廢水中銨態氮的降解速率加快.當硝化時間達到15h時,C/N分別為10、12和14的廢水中銨態氮幾乎完全被降解.當C/N在16～20時,菌株對銨態氮的降解時間增加,當反應時間為24h時,銨態氮才完全被降解(圖4).說明碳源檸檬酸鈉含量較高時,后期對該菌株有一定的抑制作用.2.2.4銨態氮降解溫度pH影響菌體對營養物質的吸收和酶的活性.根據硝化產酸原理,中性偏堿性環境有利于該反應的進行.當pH在6～9時,菌株對銨態氮的降解效果較好,反應時間為18h時,廢水中銨態氮就基本被降解.酸性或強堿性環境均不利于菌株對銨態氮的降解,需要說明的是在pH為11條件下,銨態氮降解率比pH為10時高(圖5),原因主要為強堿性環境下,部分銨態氮因吹脫作用轉化為氨氣而逸出,空白試驗中,pH為11條件下,18h后的銨態氮降解率達8.7%.銨態氮降解過程中,廢水pH呈現先下降后上升的趨勢(圖6).反應6h內,pH由初始的7.3降至6.7,主要是由反應初期硝化反應引起硝酸鹽、亞硝酸鹽的積累而致;隨著反應時間增加,pH緩慢上升,當反應時間達到24h時,pH上升到7.8.2.2.5銨態氮廢水中的菌體20～30℃范圍內,隨著溫度的升高,銨態氮降解速率加快.30℃下,廢水中銨態氮于15h內基本被降解.溫度繼續升高,銨態氮降解速率下降.50℃下,銨態氮廢水中菌體濃度無明顯增加,銨態氮濃度基本無變化(圖7),其原因是高溫下菌體的酶活性被破壞.2.2.6不同搖床轉速對銨態氮降解速率的影響溶解氧是影響硝化菌活性的重要因素之一.隨著轉速不斷升高,銨態氮降解速率逐漸增大(圖8),表明溶解氧含量的增加,有利于菌株硝化反應的進行.但150和180r·min-1下銨態氮降解速率相差很小,故其他因素搖床轉速取150r·min-1.2.2.7銨態氮降解性能對于低濃度銨態氮廢水(銨態氮濃度≤100mg·L-1),菌株JZ1-1對廢水中銨態氮的降解速率較快,18h內銨態氮基本被降解.而高濃度銨態氮廢水(銨態氮濃度>100mg·L-1)中,菌株在經歷短暫的適應期后對銨態氮表現出良好的降解性能.當銨態氮濃度在400mg·L-1以下時,48h后銨態氮降解率均在80%以上(圖9);當銨態氮初始濃度為500mg·L-1時,銨態氮降解率為61.2%.2.3菌株對廢水中銨態氮的降解效率對菌株進行連續5次繼代培養(每次培養時間18h),不同繼代培養菌株對廢水中銨態氮的降解性能見圖10.前4次繼代培養,菌株對廢水中銨態氮的降解效率由86.2%至99.3%依次升高,至第5代,廢水中銨態氮降解率穩定在99%以上,菌株降解廢水中銨態氮的穩定性較好.需要說明的是,與第3～5代相比,菌株對前2代廢水中銨態氮的降解率略低,主要原因為JZ1-1菌懸液冷凍保藏后未經活化直接用于繼代培養,對前2代銨態氮的降解效果有一定的影響.3銨態氮降解速率異養硝化菌在代謝底物時,以NH4+作電子供體,利用外加碳源提供的化學能,通過氨單加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)將氨轉化為羥胺,再經羥胺氧化酶(HAO)轉化為亞硝酸鹽或N2O.碳源不僅影響異養硝化菌的生長,也影響其硝化活性.菌株JZ1-1碳源底物較寬,在有機碳源與無機碳源上均生長良好.菌株對檸檬酸鈉的吸收利用最好,這與AlcaligenesfaecalisNo.4、ArthrobacterBD和Arthrobactersp.等的特性相似.碳源量增加有利于促進菌株的硝化性能,但碳源量過高時,部分碳源有機物會直接嵌入酶結構從而影響酶的活性,抑制硝化反應的進行.C/N在4～14時,隨著C/N增大,菌株JZ1-1對廢水中銨態氮的降解速率加快;而當C/N在16～20時,菌株對銨態氮的降解速率降低.相對于自養硝化菌,異養硝化菌所能耐受的pH范圍更寬.JZ1-1在pH為4～11均能生長和進行硝化反應,但pH在6～9范圍內,對銨態氮的降解效果最好,與AlcaligenesfaecalisNo.4的硝化活性基本一致.隨著搖床轉速的升高,溶氧量不斷增加,JZ1-1對銨態氮的降解速率加快,說明高溶氧量有利于硝化反應的進行.溫度能改變酶的活性.溫度過低,酶的活性受到抑制;過高則會導致酶失活.20～30℃內,隨著溫度的升高,菌株JZ1-1的硝化速率不斷增加,但溫度繼續升高,硝化速率呈現下降趨勢,50℃下,無明顯硝化作用發生.JZ1-1在低濃度銨態氮廢水處理中效果顯著,銨態氮濃度100mg·L-1條件下,與呂永康等從焦化廢水中分離出的異養硝化細菌相比,脫銨態氮時間減少了78h.針對中高濃度銨態氮廢水,JZ1-1亦存在一定優越性,與何霞等分離出的異養硝化菌Bacillussp.LY相比,銨態氮濃度在100～200mg·L-1范圍內,銨態氮降解率高出15%以上.與陳趙芳等分離出的菌株YY4相比,銨態氮濃度500mg·L-1條件下,銨態氮降解率高出20%以上.因此,JZ1-1對低濃度銨態氮廢水的降解效果與相關研究結果類似,但對高濃度銨態氮廢水的降解率明顯提高,在高濃度銨態氮廢水處理中具有廣闊的應用前景.研究表明,許多異養硝化菌具有好氧反硝化能力.如張培玉等篩得一株異養硝化/好氧反硝化菌qy37,反應32h后,NH4+-N濃度由138.52mg·L-1降至7.88mg·L-1,NO2--N最大積累量為0.02mg·L-1.楊宗政等從土壤中分離出一株異養硝化菌,研究發現其能通過好