黃芪多糖的提取及其鉻絡(luò)合物的制備及其降糖作用研究

糖又名多聚糖。糖的結(jié)構(gòu)包含幾個氨基酸，包括羧基（糖酸）和氨基（氨基糖）。這些氨基酸含有一個獨對電子。根據(jù)化合物配位論，可以與金屬離子形成化合物或嵌合物。黃芪多糖的分子量較大,約在10萬道爾頓以上。在藥理活性方面,有文獻報道黃芪多糖能降低葡萄糖負荷,對抗腎上腺素引起的小鼠血糖升高。而三價鉻離子是人體必需的微量元素,它是活性鉻-葡萄糖耐量因子(glucosetolerancefactor,GTF)的組成成分,能協(xié)助胰島素發(fā)揮降糖作用,促進機體碳水化合物、脂肪代謝的正常進行。將三價鉻離子與黃芪多糖絡(luò)合,目的在于產(chǎn)生協(xié)同作用,提高降糖活性。多糖絡(luò)合物的研究有一些文獻已報道過,并且集中在多糖鐵配合物的研究:王凱平等報道了當(dāng)歸多糖鐵的一些初步的理化性質(zhì);李玉賢等合成了大棗多糖鐵配合物以及茶葉多糖鐵配合物;裴曉紅等研究了白芍多糖鐵配合物的合成及其一般性質(zhì)。他們將三價鐵離子與多糖絡(luò)合之后,制成一種新型的補鐵劑治療貧血癥。既減少了由于直接補充鐵而造成的胃部的刺激;同時也發(fā)揮了以上的這些多糖(當(dāng)歸多糖、大棗多糖、茶葉多糖、白芍多糖)治療貧血癥的作用,實驗結(jié)果證實了多糖與金屬鐵離子產(chǎn)生的協(xié)同作用提高了治療效果。本實驗首次合成了黃芪多糖鉻絡(luò)合物,并將黃芪多糖與黃芪多糖鉻絡(luò)合物的降血糖作用作了初步比較。1材料和方法1.1動物ICR小鼠,雌雄各半,購于上海斯萊克實驗動物有限公司。1.2特芬材料蒙古黃芪購于上海華宇藥材總公司,產(chǎn)地為山西。1.3沖液溶液配制鏈脲佐菌素購于上海西寶公司。稱取50m,以0.1mol/L的檸檬酸鈉緩沖液4ml(pH4.5)配制成12.5mg/ml溶液。臨用前配制。取兩片格列本脲(上海信誼藥業(yè)有限公司,批號031202,2.5mg/片),碾碎,加適量1%CMC,再加生理鹽水至總體積10ml,配制成0.5mg/ml的混懸液備用。1.4紅外光譜分析穩(wěn)靈型血糖測定儀和穩(wěn)靈型血糖試紙強生(上海)醫(yī)療器材有限公司;Brucker紅外光譜分析儀EQUINOX55;UnicoUV-2102紫外-可見分光光度計。1.5方法1.5.1黃芪多糖的純化將黃芪藥材粉碎成粗粉,稱500g加10倍量水回流提取4h,共三次,過濾,合并三次提取液,減壓濃縮至1/10體積,加入5倍量95%乙醇,靜置,有沉淀析出。抽濾,用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀物,抽干即得粗多糖43g。將粗多糖用少量去離子水溶解,Sevag法除蛋白后,加3倍量的無水乙醇使之沉淀,離心,沉淀先后用無水乙醇、丙酮、無水乙醚分別依次洗滌沉淀物兩次,真空干燥,得到棕黃色粉末12g,即為純化后的黃芪多糖。紫外檢測,280nm處基本無吸收,蛋白已被除去。苯酚-硫酸法測定黃芪多糖的含量為68%。1.5.2黃芪多糖鉻絡(luò)合物的制備取5g純化后的黃芪多糖溶于100ml去離子水,70℃水浴攪拌,然后滴加2mol/LCrCl3和2mol/LNaOH,維持溶液的pH8~9。當(dāng)溶液中剛出現(xiàn)綠色絮狀沉淀時,停止加入NaOH和CrCl3,反應(yīng)液繼續(xù)70℃水浴保溫1h。取出反應(yīng)液,冷卻,離心取上清液。于上清液中加入兩倍量95%乙醇,出現(xiàn)大量沉淀,靜置,離心,收集沉淀,用無水乙醇、丙酮洗滌,冷凍干燥。得到4g黃芪多糖鉻絡(luò)合物粗品。將該絡(luò)合物粗品,用少量去離子水溶解后,用透析袋除鹽。透析液經(jīng)過濃縮后,再加入兩倍量的95%乙醇,靜置,離心,收集沉淀,無水乙醇、丙酮洗滌,冷凍干燥后得到2.5g純化后的黃芪多糖鉻絡(luò)合物。絡(luò)合物的形成必須要有中心原子和配體,周期表中絕大多數(shù)元素皆可作為中心原子,而配體必須提供至少一個孤電子對。黃芪多糖水溶液在堿性的條件下,糖上的羥基可以脫去質(zhì)子,產(chǎn)生了孤電子對,從而能和三價鉻離子進行配位絡(luò)合。1.5.3基因組化的菌株和作/位的推測團KBr壓片于紅外光譜儀上分析黃芪多糖及其鉻絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)差異,推測發(fā)生配位的基團。采用紫外分光光度儀分析黃芪多糖、三氯化鉻和黃芪多糖鉻絡(luò)合物水溶液在200~800nm波長區(qū)間的掃描圖譜。Cr的含量由電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定1.5.4模型分組及給藥劑量ICR小鼠禁食過夜,尾靜脈注射鏈脲佐菌素125mg/kg,7d后測空腹血糖值,挑選血糖高于11.1mmol/L為高血糖模型。小鼠每日灌胃給藥,連續(xù)給藥7d。空白對照組小鼠正常飼養(yǎng);模型組小鼠每日兩次i.g生理鹽水,每次0.2ml;陽性對照組小鼠每日兩次i.g格列本脲。其他分組情況及給藥劑量見表1,其中多糖給藥劑量參考藥典劑量標準,鉻絡(luò)合物劑量則按絡(luò)合物得率推算確定。配藥濃度為每10g小鼠體重0.1ml藥液。末次給藥后禁食8h,測定空腹血糖值。2結(jié)果與分析2.1黃棕櫚葉糖的定性鑒定2.1.1《好氧指數(shù)法》治療可能不適宜黃芪多糖鉻絡(luò)合物的得率為50%(相對于黃芪多糖)。它極易溶于水,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。應(yīng)用ICP-AES技術(shù),黃芪多糖鉻絡(luò)合物中鉻含量為6.28%。2.1.2氧化鉻絡(luò)合物的制備取少量黃芪多糖鉻絡(luò)合物溶于水,溶液澄清,無渾濁。而氫氧化鉻溶在水中,呈現(xiàn)絮狀沉淀。因而我們得到的黃芪多糖鉻絡(luò)合物中無氫氧化鉻。游離的三價鉻離子在透析的過程中被除去了,因而在黃芪多糖鉻絡(luò)合物中也無游離的三價鉻離子。2.2黃棕櫚酸鉻化合物的光譜分析2.2.1合峰強度的影響從紅外圖譜(圖1)可以看出黃芪多糖鉻絡(luò)合物在3400cm-1左右處的羥基伸縮振動(νO-H)的氫鍵締合峰強度,比相應(yīng)多糖的吸收峰有所減弱,且發(fā)生較大波數(shù)紅移(從3404cm-1到3435cm-1),這是由于鉻離子與羥基氧原子發(fā)生配位反應(yīng),導(dǎo)致羥基形成分子間和分子內(nèi)氫鍵能力減弱。并且黃芪多糖鉻絡(luò)合物的紅外吸收峰與黃芪多糖配位前相比,骨架特征峰未發(fā)生明顯變化,因而推測三價鉻離子與黃芪多糖的羥基形成了配位鍵。2.2.2價鉻離子的配置體紫外光譜(圖2)的結(jié)果顯示黃芪多糖鉻絡(luò)合物中三價鉻離子的最大吸收波長有紅移現(xiàn)象,分別從392nm到410nm,542nm到563nm。而作為配體的黃芪多糖本身沒有紫外吸收,可排除多糖的干擾,推測紅移是由于三價鉻離子的d軌道電子受到配位體的影響發(fā)生變化,產(chǎn)生躍遷使吸收譜帶紅移所致。從以上紅外圖譜和紫外圖譜的變化可看出,反應(yīng)后生成的產(chǎn)物與反應(yīng)前多糖圖譜相比出現(xiàn)了不同程度的變化,并且這種變化與文獻報道表征絡(luò)合物形成時的變化相符。因此,從以上定性反應(yīng)以及圖譜數(shù)據(jù),可以推測三價鉻離子與黃芪多糖發(fā)生了絡(luò)合。2.3黃鼠尾草和化合物結(jié)合物對鏈輔助細胞菌素模型的影響2.3.1各給藥前后小鼠體重的變化小鼠注射鏈脲佐菌素之后,明顯呈現(xiàn)多食、多飲、多尿的癥狀。從表1中可以得出,模型組小鼠體重較空白組有明顯的增加,說明造模的成功。而各給藥組小鼠體重都呈現(xiàn)下降趨勢,尤其是黃芪多糖鉻絡(luò)合物,在低、中、高三個劑量上,小鼠體重在給藥后都與給藥前有顯著差異(p<0.05)。陽性對照藥物格列本脲并不能降低高血糖小鼠的體重。2.3.2不同劑量組治療的治療效果從表2中可以看出黃芪多糖只有在低劑量組時,才表現(xiàn)出明顯的降血糖作用。而黃芪多糖鉻絡(luò)合物在低、中、高三個劑量組都表現(xiàn)出降血糖作用,并且與給藥前相比,均有顯著性差異(p<0.05);而后者低劑量組也與給藥前有顯著性差異(p<0.05)。因此可以得出黃芪多糖鉻絡(luò)合物的降糖效果明顯好于黃芪多糖。3價鉻及其絡(luò)合物對血糖的影響目前植物多糖的研究已經(jīng)相當(dāng)深入,有提取分離純化,構(gòu)型構(gòu)象分析和藥理活性篩選等方面的研究,但是多糖作為配體與金屬形成絡(luò)合物的研究比較少。一般研究絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)都要獲得能做X-射線衍射的單晶。但多糖的骨架較大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,難以獲得相應(yīng)的晶體,從而在絡(luò)合反應(yīng)之后,不能直接確定絡(luò)合的部位以及最終的結(jié)構(gòu)式。但是我們可以通過圖譜的數(shù)據(jù)推測其可能的結(jié)構(gòu)。文獻報道的多糖絡(luò)合物結(jié)構(gòu)多是通過一些檢測手段(如紅外光譜、紫外光譜、順磁共振等)推測得到的。本實驗將黃芪多糖經(jīng)過純化,去除了較多雜質(zhì)(主要是蛋白質(zhì)),為接下來的絡(luò)合反應(yīng)排除了蛋白質(zhì)的干擾。在合成絡(luò)合物之后,又通過透析的方法,去除了大部分的小分子雜質(zhì)。雖然在實驗中制備的絡(luò)合物也沒有直接得到明確的結(jié)構(gòu)式,但從紅外光譜和紫外光譜的數(shù)據(jù)的變化基本可以推測三價鉻和黃芪多糖發(fā)生了配位反應(yīng),造成多糖的部分結(jié)構(gòu)(主要是糖基上的締合羥基)發(fā)生了相應(yīng)改變,從而引起波數(shù)和波長的位移。通過實驗初步觀察了黃芪多糖及其鉻絡(luò)合物對于高血糖小鼠體重和血糖的影響,結(jié)果顯示高血糖小鼠在給多糖鉻絡(luò)合物之后,體重和血糖均較給藥前有降低,與給藥前相比有顯著性差異(p<0.05)。而單給多糖組只有在低劑量時才能表現(xiàn)出降血糖作用。文獻報道,三價鉻離子無明顯的細胞的毒性。以無機鹽形式(三氯化鉻)給藥后,因三價鉻離子較難進入細胞中,降糖效果并不明顯,而以絡(luò)合物的形式給藥有利于鉻離子的吸收。而黃芪多糖鉻絡(luò)合物在給