ax亞型漢族家系abo基因序列變異分析

abo血型是最重要的血樣系統，從abo血型系統的三個主要等位基因（a1、b、o）編碼到abo進行分類后，它首先被分解為雅馬拉喬等人的克隆序列。根據aa和b等位基因，藍色信號的物質由5553個氨基酸組成。這是由短氮端、疏水側和左右c重環境區組成的糖基轉移酶。近來不同人種、不同個體ABO變異的等位基因被報道。在以往的研究中,我們觀察了隨機中國漢族人群ABO血型的基因,探討了中國漢族人群ABO普通血型基因的遺傳背景。在目前的工作中,我們進一步研究了中國漢族人群變異的ABO亞型。通過測序而使我們可以推測某個氨基酸對于催化區域糖基轉移酶活性特異性或水平的影響。在這個研究中,我們發現一個Ax血型家系的數個個體中ABO基因第七外顯子有新的點突變導致表達蛋白中氨基酸改變。對象和方法1.對象一個ABO血型為Ax的家系,先證者(家系樣本編號為3)為我單位的健康捐血者,采集的血樣本共計5份,樣本編號示圖1。2.反定型紅細胞及人源抗ab/a血型正反定型、吸收放散試驗、唾液物質測定均按文獻方法,其中抗A、抗B血清(Ortho公司),抗A1、抗H血清(Dominion公司),反定型紅細胞及人源抗AB血清為自制。3.熱啟動技術使用G&T公司ABO基因分型試劑盒,能夠檢測A101、A102、B1、O1、O2、A2016種等位基因,內對照為擴增人類生長激素(HCH)基因的擴增產物為207bp。采用熱啟動技術即95℃預溫5min,然后95℃30s,60℃30s,72℃90s進行30個循環,72℃延伸5min進行擴增。PCR產物檢測:4.0%瓊脂糖,10V/cm電泳25min。紫外燈下確定結果。4.pcr擴增按文獻OlssonML設計的引物,mo-46:5′cggaattcactcgccactgcctgggtctc3′,mo-57:5′cgggatccatgtgggtggcaccctgcca3′;用于擴增第6外顯子252bp的片斷;mo-71:5′gggcctaggcttcagttactc3′,mol-101:5′cgggatccccgtccgcctgccttgcag3′(由上海生工所合成)用于擴增第7外顯子843bp的片斷。PCR反應體系包括:每種dNTP400μmol/L,Mg2+2.5μmol/L,10×PCRbuffer5μl,Taq酶3U,模板DNA500ng,每條引物0.1μmol/L,終反應體系50μl。PCR反應在PE9600擴增儀上進行,循環參數為:95℃10min;94℃60s,63℃90s,72℃60s,10個循環;94℃60s,61℃90s,72℃60s,25個循環;72℃10min。擴增產物經TakaraDNAFragmentPurificationKit(大連寶生物公司)純化,配成25～30μl的DNA測序模板。使用循環測序試劑盒(TheBigDyeTerminatorCycleSequencingKit,美國ABI公司)直接測序,測序引物與本研究擴增ABO基因第6、7外顯子的引物序列相一致,正、反方向通測,用ABI3100DNA測序儀檢測、SeqPOP6BDv1軟件分析結果。5.特異性序列的測定對上述4中第7外顯子的擴增產物,使用表1中所列的2個引物進行特異性序列的測定。測序反應的產物經純化,用ABI3100測序儀檢測,SeqPOP6BDv1軟件分析結果。由于2條測序引物分別是正反向的,測得序列的5′與3′端會產生重疊。電泳結果及序列分析被檢家系5份血型及唾液型物質結果見表2。標本編號為1、5的樣本定為O1O1,標本編號為2樣本定為A102A102,標本編號為3的樣本定為A102O1,樣本編號為4的樣本定為B1O1O1,4種電泳結果示于圖2。以正常A101、B101、O1等位基因序列對照,發現樣本編號為2、3共計2份樣本出現467C/T、829G/A、1009A/G雜合。出現的467C>T、829G>A、1009A>G突變不能確定在哪條單倍體上,對此2份樣本第7外顯子的擴增產物進行ASP序列分析,發現467T、829A、1009G突變發生在同一條單倍體基因上,這個新Ax等位基因829位、1009位序列圖譜見圖3,4。ax-7基因的突變Ax亞型是ABO血型一種較為常見的弱表現型,其血清學特點是紅細胞上A抗原位點數目稀少,而H抗原活性相應增強,與大多數B型人血清中抗A不發生凝集,而與大多數O型人抗AB發生凝集,血清中常含有抗A1,偶爾含有凝集A1也凝集A2的抗體,Ax分泌型唾液中會有正常H抗原,但A抗原極少,常常不能測出。本家系經唾液中型物質分析與血清學檢測,可以確定出現的弱A表現型為Ax。國外已報道的Ax亞型等位基因有8種,見表3。在日本,3份被檢Ax表型的個體,2份為646T>A,為ABO*Ax-1,另外1個與A102序列一致。Ax-1與A101相比,只有646位核苷酸T轉變為A,導致了216位氨基酸由P變為I,糖基轉移酶的活性大大降低。Ax-4與Ax-1相比,多了一個無義突變681G>A。Ax-7與A101相比,在996位核苷酸G轉變為A,導致了332位變為終止密碼。Ax-8與A101參比序列相比,是在第6內含子中發現眾多突變,內含子的變異會影響mRNA的剪接。其余5種Ax等位基因,都是染色體上DNA重組導致雜合基因,而使得翻譯的糖基轉移酶活性也大大降低。5份Ax等位基因都含有646T>A,681G>A,771C>T,829G>A這4種變異,而這4種突變點均能在O1v中找到。Ax-2是含297A>G這個典型的B等位基因突變,文獻上把它定為B-O1v;Ax-3交換位置是在外顯子6的nt298與內含子6nt41之間,文獻上把它定為A1-O1v;Ax-5交換位置在內含子6中。Ax-6交換位置也在內含子6中,但位置與Ax-5不同,文獻上均把Ax-5、Ax-6定為A1-O1v雜合。我們在這個家系中發現兩例(1例Ax亞型,1例A型),標本A基因含467C>T、829G>A、1009A>G突變。這3個突變將導致156位氨基酸由脯氨酸(Pro)變為亮氨酸(Leu),277位氨基酸由纈氨酸(Val)轉變為甲硫氨酸(Met),337位氨基酸由精氨酸(Arg)轉變為甘氨酸(Gly)。在A基因中,已有文獻報道過467C>T、1009A>G這兩個點突變,含這兩個突變的A基因被定為A205基因,我們以往的研究也表明在中國人群中A2亞型的分子結構以A205占優勢。但在A205基因的基礎上多了個829G>A突變,這在所有人種中未見報道,這個Ax新變異等位基因已獲Genbank的注冊號(DQ092380)。這個新基因在該家系中呈穩定遺傳,先證者母親(樣本編號2)表現為A型,但經基因分析,且其女為Ax型,可以知道其基因型為A102/Axnew。由于A205型基因中也有464C>T與1009A>G兩個突變,Ax新基因與A205基因相比,其控制的血型糖基轉移酶表達出來的A抗原血清學活性與A2糖基轉移酶相比有著極大的降低,所以可知,829位G>A突變是導致A型糖基轉移酶活性大大降低的主要原因。推測在Ax等位基因mRNA翻譯成轉移酶后,由于277位氨基酸由纈氨酸轉變為甲硫氨酸后,蛋白構象