富硒猴頭菇對小鼠腸道菌群的影響

猴頭是屬于擔子菌亞門、異距雞子菌亞門、無距雞子菌亞門、無褶皺菌、猴頭菌科、虎頭菌科。猴頭及其提取物廣泛用于胃腸道疾病特別是對胃腸道炎癥和潰瘍以及消化道癌癥輔助的治療。有人對猴頭菌制備物(猴頭菌子實體制備液、猴頭菌深層培養物以及猴頭菌多糖)的抑菌活性進行實驗,證明猴頭菌各制備物對細菌、酵母菌和霉菌均有不同程度的抑制作用。體外實驗和動物實驗證明,有機硒有著很強抗菌活性,有顯著減少小鼠腸道中的大腸埃希菌數量的效果。許多補益類中草藥對雙歧桿菌、嗜乳酸桿菌有明顯的促進生長作用,包括枸杞子、地黃、五味子、黃芪和白術等。本文將考察富硒猴頭凍干粉對小鼠腸道菌群的影響,判斷其是否具有調節腸道菌群的效果。1材料和方法1.1頭菇凍干粉的制備猴頭菇凍干粉,由猴頭菇鮮品冷凍干燥制得。富硒猴頭菇凍干粉是在猴頭菇培養基中加入亞硒酸鈉培養,冷凍干燥制得,樣品中有機硒含量156μg/g。昆明小鼠,雄性,清潔級,體重18～22g。1.2給藥劑量及給藥時間50只小鼠隨機分為5組,分別為蒸餾水對照組,普通猴頭菇凍干粉組和富硒猴頭菇凍干粉高、中和低3個劑量組,每組10只。高、中和低劑量組分別給予富硒猴頭菇凍干粉3、0.3和0.03g/(d·kg·BW)。普通猴頭菇凍干粉對照組給予0.3g/(d·kg·BW)普通猴頭菇凍干粉,空白對照給予等量蒸餾水。灌胃給藥,灌胃容量0.3ml/10g體重。每天1次,持續3周。除灌胃外,小鼠給予正常飼料和飲水。1.3新鮮糞便的采集分別在灌胃前,灌胃后第21天,停止灌胃后3d無菌采集新鮮糞便樣。輕壓小鼠直腸部位在無菌環境下收集新鮮糞便,裝于事先滅菌的EP管中,每組實驗小鼠收集5個標本。立即將EP管封口,記錄重量,-20℃冷凍保存。1.4u3000結論DNA的提取:根據楊美芬等的方法,糞便樣本加9倍體積的PBS(0.05mol/L,pH7.4)充分混勻,低速離心(1500r/min)5min,取上清,重復上述過程3次。合并上清,高速離心(10000r/min)3min取沉淀,沉淀用PBS洗3次,水洗1次,加入50μl水和50μl1%TritonX-100,100℃煮沸5min立即投入冰水中備用。DNA的純化:將提取步驟所得液體高速離心(14000r/min)1min取上清,加入等體積酚、氯仿,振蕩10s,高速離心10min取上清,加入2～2.5倍4℃95%乙醇,液氮冷凍20min后高速離心1min,取沉淀,乙醇重復沉淀1次,揮干乙醇,加入50μlTE,-20℃保存。1.5保菌劑的制備取大腸埃希菌和乳酸菌培養好的菌液(菌種來源:實驗室保藏),用血球計數板確定濃度(大腸埃希菌濃度為4.4×107CFU/ml,乳酸菌濃度為1.86×107CFU/ml),取1ml菌液,10000r/min離心3min,PBS清洗,破碎,純化步驟同1.4。雙歧桿菌用PCR產物,測定A值。參照分子克隆,計算出拷貝數。1.6pcr反應taq酶活性。引物特異性:取各DNA標準品與一個糞便樣品DNA進行常規PCR反應,反應體系為25μl:10×Buffer2.5μl,0.25mol/L4×dNTP0.5μl,25mmol/LMgCl22.5ml,2μmol/L上下游引物各0.5μl,5U/μlTaq酶0.15μl,DNA模板3μl,水15.35μl。反應程序為:95℃5min后,95℃15s,55℃1min,72℃45s,共35個循環,最后72℃10min延伸結束。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。1.7熒光定量pcrre作cy標準曲線的制作,將1.5所得DNA做10倍系列稀釋,進行SYBRGreenⅠ作為熒光染料的實時定量PCR反應。反應體系25μl:SYBRPremixExTaqTM12.5μl,ROXReferenceDye0.5μl,上下游引物各0.5μl,模板2μl,水9μl。采用ABIPRISM7500FastReal-TimePCRSystem進行擴增。反應程序為:95℃預變性5min,95℃15s,60℃1min,80℃10s,讀取熒光數據,共40個循環;反應完成后進行溶解曲線分析,從60℃到95℃緩慢升溫,檢測熒光數據。根據讀取的熒光數據,由系統軟件自動分析Ct值并生成標準曲線。樣品的16SrDNA定量分析,將各糞便DNA樣本分別進行3種細菌的16SrDNA熒光定量PCR反應。反應體系與標準曲線相同。每次實驗同時做標準曲線。每個樣品同時做3個復孔。樣品根據標準曲線得到各樣品中3種細菌的數量。1.8組患者xss的比較樣品數據導入SPSS18.0統計軟件進行分析,結果以xˉ±sxˉ±s表示,應用單因素方差分析比較組間差異。以P≤0.05為差異有統計學意義,以P≤0.01為差異有顯著統計學意義。2結果2.1小鼠腸道pcr擴增產物的特異性分析用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析,可見,各標準菌株PCR產物均顯示出特異性條帶,與預期的DNA片段長度相吻合。糞便樣本PCR擴增產物除目標條帶外,并無明顯非特異性擴增條帶。可見各引物特異性較好,適合用于實時定量PCR反應(見圖1)。2.2擴增產物的溶解曲線以不同拷貝數的標準品的對數為橫坐標,Ct值為縱坐標得到各細菌的標準曲線,各菌的標準曲線見圖2所示。每次反應完成后進行溶解曲線分析,可見溶解曲線均為單峰,說明擴增產物單一(圖3)。擴增產物的TM值分別為:大腸埃希菌屬81.24;乳酸桿菌屬84.82;雙歧桿菌屬88.55。與預期產物TM值相符,說明所得擴增曲線為目標產物擴增曲線。2.3高劑量富硒猴頭菇凍干粉對小鼠糞便中雙歧桿菌的影響實驗期間小鼠糞便中腸桿菌屬的變化見表3所示,實驗期間小鼠糞便中腸桿菌屬與對照組相比無明顯變化(P>0.05)。經口給予富硒猴頭菇凍干粉21d后,小鼠腸道中的大腸埃希菌生長繁殖未受明顯抑制。對小鼠腸道雙歧桿菌數量的影響見表4所示。灌胃富硒猴頭菇凍干粉后,實驗組小鼠糞便雙歧桿菌數量有所增加,與對照組相比達到顯著水平(P<0.05),但高劑量灌胃富硒猴頭菇凍干粉后,小鼠糞便中的雙歧桿菌數量與對照組相比差異沒有統計學意義,可能是由于雙歧桿菌對于腸道環境中的硒濃度較為敏感,實驗高劑量組的小鼠腸道中的硒濃度過高,對雙歧桿菌的生長繁殖表現出一定程度的抑制作用。實驗期間小鼠糞便中乳酸菌的變化見表5所示,對照組小鼠糞便中腸桿菌屬無明顯變化,實驗期間菌數差異無統計學意義(P>0.05);實驗組小鼠經口給予富硒猴頭菇凍干粉以后,高劑量組小鼠腸道中乳酸菌的數量增加,達到顯著水平(P<0.05)。實驗結束后第3天,實驗組小鼠乳酸菌數量與對照相比仍然較多。說明富硒猴頭菇凍干粉對乳酸菌的生長繁殖有一定的促進作用。2.4富碘雞干粉對實驗大鼠體重的影響實驗中各實驗組小鼠與正常對照組相比,體重均無顯著差異。實驗結束解剖小鼠,未見異常。3腸道微生態調節劑動物實驗結果顯示,經口給予富硒猴頭菇凍干粉21d后,小鼠腸道中有益菌乳酸菌的增殖得到促進,差異有統計學意義(P<0.05),證明了富硒猴頭菇凍干粉對小鼠腸道菌有一定的調節作用。實驗結束3d后,小鼠腸道中乳酸菌數量與對照相比仍然較多,但雙歧桿菌數量恢復正常。與普通猴頭對照相比,富硒猴頭菇對乳酸菌的調節效果在3d后仍然保持(P<0.05),在調節腸道菌群方面有一定的優勢。在本實驗的給藥濃度范圍內,未見對腸道中大腸埃希菌生長繁殖的抑制。富硒猴頭菇可能是通過其中含有的單糖,多糖等成分對小鼠腸道中的有益菌產生影響,而調節效果的持續的原因可能是有機硒成分作用與免疫系統而改善腸道環境。富硒猴頭菇對腸道菌群影響的實際作用機制有待進一步實驗研究。猴頭菌促進兩種益生菌生長的原因可能為:猴頭中的糖分經腸道酶類分解成低聚糖類,如海藻糖,β-葡聚糖等,能促進雙歧桿菌的生長。猴頭菇中的硫胺素、核黃素等也是重要的益生菌促生長物質。猴頭多糖經微生物發酵產生VFA(揮發性脂肪酸),VFA是腸道中抑制病原微生物的重要因素。高濃度的VFA可明顯抑制沙門菌等的生長。同時發酵產生的酸性物質也可降低腸道pH,從而抑制某些pH敏感菌的生長,促進益生菌增值。硒作為GPx活性中心,腸道環境中硒含量的增加,將使菌體內GPx活性增強,起到清除自由基、解過多的過氧化氫、保護細胞膜的作用。另外,有研究表明GPx的類似物Se-2F3-ScFv能夠阻止LDH(乳酸脫氫酶)的釋放并保持其在正常水平內恒定。而LDH作為乳酸菌代謝的重要酶類,能夠催化乳酸菌產生乳酸。以降低腸道環境中的pH,抑制有害菌生長。市面上最常見的腸道菌群調節劑為益生菌活菌制劑,易受抗生素影響,而富硒猴頭菌通過不同于活菌制劑的途徑調節腸道菌群結構,抗生素對其影響較小。且硒是谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX)的組成部分,在代謝中傳遞電子,具有抗氧化、增強免疫、抗腫瘤的作用。富硒猴頭菇含有豐富的硒,能夠提高機體抗氧化能力,起到抗炎作用。對于接受抗生素治療的胃腸道炎癥患者,富硒猴頭菇不失為一種優秀的腸道微生態調節劑。實驗證明富硒猴頭調節乳酸菌數量的作用在實驗結束3天后仍然持續。硒提高宿主非特異性免疫功能,提高抵抗抗病原菌的能力。并且能夠增強B淋巴細胞增殖功能,增強體液免疫。可能通過免疫系統影響致病菌在腸道上皮細胞的粘附,使腸道內形成一個較為穩定的環境為乳酸菌的穩定造了條件。并且,硒進入到乳酸菌菌體內,參與多種酶的作用,尤其的作為GPx氧化應激系統中酶的活性中心,起著抗氧化保護細胞的作用。硒的摻入保護了乳酸菌體氧化還原物質的穩定,起到保護菌體的作用。從而使乳酸菌數量穩定,使調節效果得到持續。猴頭菌具有調節腸道菌群的作用,而有富硒猴頭中的有機硒成分使其調節效果具有一定持續性。