PCR

_UU、NG、CT測定

LOREMIPSUMDOLORPCR技術根本原理

一、定義PCR〔PolymeraseChainReaction〕即聚合酶鏈式反響，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA?？捎糜诨騽e離克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態性研究等許多方面。二、PCR反響的根本過程①變性〔denaturation〕將模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA經加熱至94℃左右一定時間后，雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，以便它與引物結合，為下輪反響作準備。二、PCR反響的根本過程②退火(annealing)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；二、PCR反響的根本過程

③延伸〔extension〕DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反響原料，靶序列為模板，按A-T、C-G堿基配對與半保存復制原那么，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保存復制鏈。重復變性--退火--延伸的循環過程，就可獲得更多的“半保存復制鏈〞，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。PCR反響體系的根本成分模板DNA特異性引物DNA聚合酶dNTPMg2+的緩沖液。PCR的反響動力學PCR的三個反響步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反響最終的DNA擴增量可用Yn＝X*(1＋E)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，E表示平均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反響中平均效率達不到理論值。反響初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，但隨著PCR產物的逐漸積累，其對擴增過程出現負作用，再加上酶的消耗疲勞，整個擴增將進入線性增長期或平臺期，此時，擴增產物不再呈指數增加，即出現“停滯效應〞，這種效應稱平臺期。實時熒光定量PCR原理：通過對PCR擴增反響中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反響中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反響的進行，PCR反響產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖(如圖)。CT值與起始模板的關系研究說明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小。利用起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值〔如圖所示〕。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團別離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。探針熒光技術原理

將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反響規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反響體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。實驗步驟解脲支原體DNA測定實驗步驟

試劑配制樣本數〔樣本數＝待測標本數+質控品5個+1〕n配制反響液UUPCR緩沖液n×18ul、Mgcl2n×3ul、UU熒光探針n×3ul、Tap酶n×2ul配制，按26ul分裝。解脲支原體DNA測定實驗步驟標本漂洗液200ul→13000rpm離心10分鐘→吸棄上清→參加50ulDNA裂解液→震蕩混勻、溫浴10分鐘→13000rpm離心2分鐘→上樣→低速離心數秒→全自動熒光PCR儀擴增程序：50℃-----1分鐘94℃-----2分鐘94℃5秒→60℃30秒〔循環40次〕實驗結果結果解讀一.PCR出現假陰性原因：1．模板因素：〔1〕模板中含有雜蛋白；〔2〕模板中含有Taq酶抑制劑；〔3〕模板中蛋白質殘留，特別是染色體中的組蛋白殘留；〔4〕提取制備模板時喪失過多；〔5〕模板核酸變性不徹底。解決：1.配制有效而穩定的消化處理液;2.提取程序固定,不宜隨意改動；3.模板DNA的溶解液應固定不變。2．酶失活1.〕酶本身的質量問題(供給商的問題〕；2.〕酶存放時間太長；3.〕酶存放方式不當，或其他意外原因；4.〕忘記添加Taq酶。3、引物：質量；濃度；兩條引物的濃度是否對稱等。解決：1.選定一個好的引物合成單位;2.引物濃度不僅要看OD值，稀釋時更要平衡其摩爾濃度；3.引物應高濃度小量分裝保存，防止反復凍融或長期冷凍保存，導致引物的變質降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；4.引物設計不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。4、Mg2+濃度：Mg2+濃度對PCR擴增效率影響極大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性；濃度過低那么影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗，出現假陰性。5、物理原因：1.變性溫度低，變性時間短；2.退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率；3.延伸時間過短等。二.PCR出現假陽性原因：1.引物設計不適宜。1〕.選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，從而擴增出非目的性序列的PCR產物。2〕.靶序列太短或引物太短導致特異性不強。解決：選擇特異性強的區段設計引物。2.靶序列或擴增產物的交叉污染。解決方法：1.操作時小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管污染環境。2.除酶及不耐熱物品外，所有試劑及耗材均應高溫高壓消毒，所用離心管及槍頭均應一次性使用。3.必要時，加樣本前，反響管及試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。三.出現非特異擴增帶原因：1.引物與靶序列不完全互補，或引物聚合形成二聚體；2.Mg2+濃度過高，退火溫度過低，PCR循環次數過多；3.酶的質量不過關，或加Taq酶的量過多。解決方法：1.必要時重新設計合成引物；2.減低酶量或調換另一來源的酶；3.降低引物量，適當增加模板量，減小循環次數；4.適當提高退火溫度或采用二溫度點法〔94℃變性，65℃左右退火與延伸〕臨床意義——為臨床的診斷與治療提供實驗室依據解脲支原體DNA定性解脲支原體在非淋球菌性尿道炎中，有50%是由本病引起的。如果孕婦生殖道帶有解脲支原體，可通過胎盤感染胎兒引起早產、死胎，分娩時可引起新生兒呼吸道感染。另外還可導致不孕不育。因此，婦產科普查解脲支原體有很重要的意義。淋球菌DNA定性男性可發生尿道炎。女性可引起尿道炎及子宮頸炎。不經治療或治療不徹底，可致慢性感染。胎兒經產道時，可感染淋病性急性結膜炎。因此，在淋病的早