納米復合材料修飾玻碳電極檢測過氧化氫

在化學、藥物、臨床診斷和環(huán)境保護等方面，h2的分析和檢測起著非常重要的作用。而且H2O2廣泛存在于食物中,高濃度時對人體眼睛、皮膚等都具有較大的傷害。H2O2也是人體內(nèi)多種反應的代謝中間物,其濃度可用于間接測定多種目標物質(zhì)的濃度。因此,對H2O2的分析檢測一直吸引著廣大研究工作者的興趣。目前,H2O2的檢測方法主要有光譜測量、滴定分析、熒光分析和電化學分析等,其中電化學分析方法具有制備簡單、靈敏度高、選擇性好、便于操作等優(yōu)點。早期的電化學分析方法是利用酶對底物專一性響應的特點,通過不同材料將酶固定在電極上,構(gòu)建高靈敏的過氧化氫傳感器。但是如何保持傳感器酶的生物活性以及提高酶與電極之間的電子傳遞,仍然是酶傳感器制備過程中的難點問題。近年來,由金屬納米粒子制備的納米復合膜無酶傳感器對H2O2顯示出優(yōu)良的還原效果。已有文獻報道Ag納米粒子對H2O2的還原有很強的催化作用。Cui等將Ag納米粒子固定在網(wǎng)狀DNA上制備修飾電極,并用于H2O2的檢測且取得了較好的結(jié)果,但是H2O2的檢測電位為-0.4V,在該電位下,尿酸,抗壞血酸等物質(zhì)對H2O2的檢測會造成干擾。Lu等利用層層自組裝的方法制備了聚合高分子銀納米粒子復合材料無酶傳感器,結(jié)果顯示該傳感器對H2O2有良好的催化活性,檢測上限達到110mmol/L,但其檢測靈敏度較低,且制備過程繁瑣。導電聚(3,4-乙烯基二氧噻吩)(PEDOT)因其具有低的氧化電位,良好的光學特性、高的導電性、快速的摻雜與去摻雜過程、良好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性引起了眾多研究者的關(guān)注。而且PEDOT可以在室溫水溶液中合成,為酶、抗體、DNA和蛋白質(zhì)等生物分子與導電聚合物復合材料的合成提供了良好的途徑。固定生物分子有多種途徑:在聚合前通過聚合物的單體分子鍵合來固定生物分子;在聚合的過程中利用聚合物的包埋作用將生物分子包在聚合物膜內(nèi);在聚合物合成后通過聚合物與生物分子的共軛作用或物理吸附作用固定生物分子。Keith等利用PEDOT固定病毒分子制備了生物傳感器,進而研究了傳感器的某些電化學性質(zhì)。Julien等研究發(fā)現(xiàn)DNA與PEDOT之間不僅有DNA分子上帶負電的磷酸基團與帶正電的PEDOT之間的靜電作用,還有非特定的相互作用。我們課題組已經(jīng)將DNA電沉積到PEDOT膜表面,得到了比表面積大、導電性強、穩(wěn)定性高的復合膜,并對NO-2進行了分析檢測,獲得了較好的分析結(jié)果。本實驗利用導電聚合物良好的生物相容性,將DNA固定在PEDOT膜上,利用DNA分子特有的雙螺旋結(jié)構(gòu),將Ag納米粒子電沉積到DNA分子上,得到分散性和催化活性更高的Ag納米材料復合膜修飾電極,試圖利用Ag納米粒子高的電催化活性實現(xiàn)對H2O2的電催化還原。實驗結(jié)果顯示,工作電位為-0.3V時,H2O2在修飾電極上的催化還原電流與H2O2濃度在10μmol/L～16mmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,可以作為無酶傳感器檢測H2O2,檢出限達2.36μmol/L(S/N=3),而且工作電位為-0.3V,有效的避免了尿酸(UA),抗壞血酸(AA),葡萄糖(Glucose)的干擾,結(jié)果令人滿意。1實驗部分1.1修飾電極的制備3,4-乙烯基二氧噻吩(EDOT)(蘇州貝利醫(yī)藥原料有限公司),十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(天津科密歐化學試劑有限公司),H2O2(天津市光復精細化工研究所),DNA鈉鹽(百靈威科技有限公司),氯化鉀,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉等都為分析純,實驗室用水均為二次蒸餾水。修飾電極的制備在273A恒電位/恒電流儀(EGandGUSA)上進行,循環(huán)伏安法,計時電流法實驗均在CHI660b電化學工作站(CHInc.上海辰華儀器公司)上進行,掃描電子顯微鏡(SEM,日本JSM-6380LV),SK3300L型超聲波清洗器(上?？茖С暡▋x器廠),pHs-3型酸度計。分析測試所用體系為三電極體系:玻碳電極(GCE)為工作電極,Ag/AgCl(sat.KCl)為參比電極,鉑絲為對電極。實驗中所有電位都是相對于參比電極。1.2nano-ag/d-dna/peat/gce的制備先將玻碳電極(Φ=3.0mm)在金相砂紙上打磨成鏡面,然后用0.3μm和0.05μm濕潤的Al2O3在拋光布上拋光,用二次蒸餾水沖洗干凈,再分別在乙醇和二次蒸餾水中超聲1min,用氮氣吹干。干凈的電解池中配置含10mmol/L3,4-乙烯基二氧噻吩(EDOT)、0.75cmc十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(1cmc=0.87mmol/L)和0.05mol/LKCl的水溶液,聚合前通高純氮氣10min除去溶液中的氧氣,在273A恒電位/恒電流儀上使用恒電流法,以0.4mA/cm2的電流密度電聚合160s,取出后依次用丙酮和二次蒸餾水沖洗3次以除去未聚合的單體和電極表面的CTAB。再將電極轉(zhuǎn)移到0.1mol/LpH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS),以循環(huán)伏安法在-0.2V～0.6V范圍內(nèi)掃描10圈至得到穩(wěn)定的伏安曲線,制得PEDOT/GCE修飾電極,然后將該修飾電極置于含2mg/mLds-DNA鈉鹽的0.1mol/LKCl溶液中,在+1.5V恒電位電沉積30min,即得到ds-DNA/PEDOT/GCE,將修飾電極取出后用二次蒸餾水沖洗,放入0.1mol/LpH7.0PBS中,在0～0.6V范圍內(nèi)掃描至穩(wěn)定,再轉(zhuǎn)移到含3mmol/LAgNO3的0.1mol/LKNO3溶液中,在-0.2V下恒電位電沉積120s,得到Nano-Ag/ds-DNA/PEDOT/GCE。電極不用時于4℃冰箱保存。2結(jié)果與討論2.1修飾電極的制備導電聚合物膜的結(jié)構(gòu)與厚度對修飾電極性能具有很大的影響,為了獲得導電性高,性能優(yōu)良的導電PEDOT膜,對PEDOT膜制備過程中陽離子表面活性劑CTAB的濃度,聚合時電流密度等實驗條件進行了優(yōu)化。我們選擇含有0.1mol/LKNO3作支持電解質(zhì)的1.0mmol/LK3Fe(CN)6為探針分子進行實驗,通過測定3-/4-探針在導電PEDOT膜表面的CV曲線,比較CV曲線的還原峰電流來確定膜對探針的導電性。因為EDOT在水中溶解度約為15mmol/L(2.1g/L20℃),所以我們選擇10mmol/LEDOT,0.05mol/LKCl和不同濃度的CTAB。因為在不同電流密度下制備的膜表面形態(tài)不同,所以導電性也有所不同。另外,在水溶液中,EDOT電聚合比較困難,加入陽離子膠束可以降低EDOT的氧化電位,加入陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑和一定的有機化合物結(jié)合可以使溶液中有機單體形成微乳相,能夠提高EDOT在水中的溶解度,從而在電化學聚合EDOT時可以提高其導電性和可加工性。圖1(a)為固定電流密度,在含有不同濃度CTAB的溶液中電聚合制備的PEDOT薄膜在探針溶液中的實驗結(jié)果,圖1(b)為固定CTAB濃度,在不同電流密度下電聚合制備的PEDOT在探針溶液中的實驗結(jié)果?？梢?當CTAB濃度為0.75cmc(0.69mmol/L),電流密度為0.4mA/cm2時所得到的PEDOT膜對探針K3Fe(CN)6導電性最高,有利于反應物在膜電極表面的電子傳遞。為了得到對H2O2電催化能力強的復合膜,我們通過改變EDOT的電聚合時間來控制膜的厚度,從而制備了不同的修飾電極,電聚合時間與H2O2電催化還原電流的關(guān)系如圖2所示。結(jié)果表明,電聚合時間為160s時,制備的修飾電極對H2O2催化能力最強,所以選擇聚合EDOT的時間為160s。根據(jù)文獻,電沉積DNA的電位為+1.5V。實驗發(fā)現(xiàn),在含0.1mol/LKCl的DNA鈉鹽水溶液中采用恒電位法電沉積DNA,沉積時間30min得到的ds-DNA-PEDOT膜較穩(wěn)定,且制備的復合膜對H2O2的電催化還原能力最好。Ag納米粒子的電沉積按照文獻方法,選用3mmol/LAgNO3溶液,在-0.2V下恒電位電沉積120s。2.2pefig電沉積dna進行膜表面形貌變化圖3(a)為制備的導電PEDOT的掃描電鏡圖,由圖中可以看出,PEDOT膜表面粗糙,增大了膜的比表面積,有利于電子傳遞。PEDOT電沉積DNA后,膜的表面形貌變化不大(未給出)。圖3(b)為PEDOT沉積DNA和納米Ag后的復合膜表面形態(tài),可以看出,膜的表面形態(tài)發(fā)生了明顯的變化,膜表面的顆粒變得比較均勻,這可能與DNA的存在有關(guān)系。2.3ag納米粒子的電化學表征圖4(a)為不同電極在1mmol/LK3Fe(CN)6中的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以看出,3-/4-電對在裸玻碳電極上有一對很好的氧化還原峰(曲線a),峰電位差為72mV。而在導電PEDOT修飾電極上的氧化還原峰形較好,峰電流明顯增加,且背景電流也較大(曲線b),原因是導電PEDOT本身帶正電,有利于3-/4-電對在膜與電極表面的電子傳遞,背景電流增大則是由于PEDOT膜的充電電流所致。曲線c為在PEDOT膜上沉積DNA后的循環(huán)伏安曲線,可以看出ds-DNA/PEDOT修飾電極背景電流明顯降低,沒有氧化還原峰出現(xiàn),這是因為帶正電的PEDOT和帶負電的DNA通過強烈的靜電作用可以形成穩(wěn)定的DNA-PEDOT膜,而且DNA分子改變了PEDOT膜的性質(zhì),阻礙了3-/4-探針分子在膜上的電子傳遞。當DNA上沉積納米Ag后,3-/4-的氧化還原峰電流有所增加(曲線d),說明有Ag納米粒子膜的形成,但在含有KCl的鐵氰化鉀溶液會對修飾電極上的銀納米粒子膜造成損害,我們記錄的是第一圈掃描曲線。該實驗結(jié)束后復合膜修飾電極需要重新制備。電化學阻抗也是表征修飾電極的有效手段之一,圖4(b)給出了不同電極阻抗圖。由圖可見,裸電極表面經(jīng)過修飾后,阻抗圖發(fā)生明顯變化,導電PEDOT由于具有高的導電性,且?guī)в姓姾?有利于探針分子的電子傳遞,圖譜呈一直線(曲線b),在導電PEDOT表面修飾DNA后,阻抗顯著增大(曲線c),原因是DNA鏈上帶負電的磷酸基團與探針分子發(fā)生排斥作用,同時也說明DNA成功修飾在電極表面。當在DNA表面沉積上一層Ag納米粒子時,復合膜的阻抗值稍大于裸電極的阻抗值(曲線d),小于修飾有DNA-PEDOT膜的阻抗值,說明Ag納米粒子沉積到了電極上,與循環(huán)伏安法表征的結(jié)果一致。我們用循環(huán)伏安法研究了不同修飾電極上的Ag納米粒子在PBS中的氧化還原行為,結(jié)果如圖5所示。由圖可見,沉積在玻碳電極表面、PEDOT膜上以及ds-DNA-PEDOT膜上的Ag納米粒子都在+0.5V出現(xiàn)一個氧化峰,在+0.15V處出現(xiàn)一還原峰,為Ag+還原為Ag納米粒子的還原峰?？梢?Ag納米粒子電沉積在PEDOT膜表面比沉積在玻碳電極表面的氧化還原峰電流有著明顯的提高,顯示出更好的氧化還原能力,這是Ag納米粒子同PEDOT上硫原子協(xié)同作用的結(jié)果,而在ds-DNA-PEDOT膜表面,Ag納米粒子氧化還原峰電流最大,這是由于DNA的特有的雙螺旋結(jié)構(gòu)能夠使沉積的Ag納米粒子的量更大,Ag納米粒子更加均一,更加穩(wěn)定。2.4nano-ag/ds-dna/pefig/gce的電化學還原能力圖6為1mmol/LH2O2在不同修飾電極上的循環(huán)伏安響應曲線(a～d)。圖中曲線d′為Nano-Ag/ds-DNA/PEDOT/GCE在不含H2O2的底液中的循環(huán)伏安曲線。通過對比可以看出,沒有加入H2O2時,循環(huán)伏安曲線還原電流峰很小(曲線d′),當加入1mmol/L的H2O2后,Nano-Ag/ds-DNA/PEDOT/GCE修飾電極產(chǎn)生的還原電流峰(曲線d)比其他幾個修飾電極上的還原電流峰都要大(曲線a,b,c),說明復合膜修飾電極較其他修飾電極對H2O2有更好的電催化還原作用,且曲線d的峰電位在-0.3V,比曲線a的峰電位(-0.45V)正移了150mV,在這個電位下,H2O2的催化還原電流較大,背景電流較小,有著較好的信噪比,而且在測定過程中能夠有效避免溶液中其他電活性物質(zhì)的干擾。雖然ds-DNA/GCE上也有較大的還原電流,但直接沉積在GCE上的DNA穩(wěn)定性較差,容易脫落,造成電化學響應逐漸減小。Nano-Ag/ds-DNA/PEDOT/GCE對H2O2有著更強的電催化還原能力,是因為PEDOT具有良好的生物相容性和導電性,為DNA的附載和電子的傳遞提供了一個良好的環(huán)境,有利于Ag納米粒子沉積在DNA表面,而且修飾電極表面較為均勻,利用電沉積的方法可以快速的形成穩(wěn)定的Nano-Ag/ds-DNA/PEDOT復合膜,而且DNA的特殊結(jié)構(gòu)可以沉積更多且分散性較好的Ag納米粒子,從而有效的促進H2O2的電化學還原。因此,該修飾電極可以作為無酶傳感器用于H2O2的檢測。2.5電催化還原電流如圖7(a)為利用Nano-Ag/ds-DNA/PEDOT/GCE作為傳感器檢測H2O2時的安培響應曲線,可見,當連續(xù)加入一定濃度H2O2溶液后,傳感器對H2O2的電催化還原電流呈階梯形增長,達到95%穩(wěn)定電流的響應時間小于5s,說明該傳感器對H2O2的催化還原具有較快的電流響應。圖7(b)為傳感器的電流響應與H2O2濃度的線性關(guān)系曲線,結(jié)果表明,催化還原電流與H2O2濃度在10μmol/L～16mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,線性回歸方程為:Ipc/μA=1.01+15.