普洱茶特征成分提取物抗疲勞、降膽固醇及毒理學效應研究

普洱茶是云南漢江流域茶樹的起源地。這是在云南茶葉的新鮮過程中經過加工而成的一種特殊茶。它是由云南的干綠茶通過緩慢自然、自然、人工和固體發芽而制成的發酵茶，包括普洱散茶和普洱散茶。還有獨特的質量特點。茶色蒼白，湯色紅淡，香味獨特，陳香，葉底褐紅色，口感溫和甘甜。現代醫學臨床驗證,普洱茶對人體有保健作用。如:降脂減肥、抗動脈硬化、防癌與抗癌、護胃、養胃及抗衰老等作用。在普洱茶加工過程中,大部分的多酚類物質、茶黃素及茶紅素氧化、聚合,形成茶褐素(TB),使其含量成倍增加,從而使茶湯的收斂性和苦澀味明顯降低。此外,水溶性多糖大幅度增加,為形成云南普洱茶特有的功能與品質奠定了基礎[3~6]。為了進一步證明這些成分所起的作用以及為普洱茶深加工提供重要參考,本文探討了普洱茶特征成分提取物對昆明種小白鼠的抗疲勞、降膽固醇及其毒理學效應。1材料和方法1.1實驗動物清潔級(動物合格證號SCXK(渝)20020004)昆明種小白鼠,由第三軍醫大學實驗動物中心提供。1.2加沉淀物中加味茶質成分提取物的制備先將普洱茶用熱水浸泡,過濾后的濾液再用乙醇沉淀,此沉淀物經真空干燥后即得普洱茶特征成分提取物,其主要由茶褐素58.3%,可溶性多糖33.3%,可溶性蛋白質8.0%及少量的茶紅素、茶黃素、水溶性果膠等組成。1.3功能實驗方法：從普洱茶中提取資源成分1.3.1小鼠尾血及血清尿素氮的測定采血及飼喂方法:實驗小鼠先按常規方法飼喂一周,使其適應環境,減少應激反應帶來的不便和實驗誤差。普洱茶特征成分提取物組:每天飼喂普洱茶特征成分提取物每只鼠25mg(相當于每公斤體重飼喂500~600mg),連續飼喂10d。普洱茶水浸液組:每天飼喂普洱茶水(將250mg普洱茶浸泡于熱水中,過濾得浸泡液10ml),連續飼喂10d。對照組:每天供給足量的蒸餾水和飼料,連續飼喂10d。各組小鼠試驗過程中,正常供給飼料。采取飼喂前后小鼠尾血,分離血清后置于Eppendorf管中,4℃冰箱保存,用于游泳前血清尿素氮的測定。游泳試驗:小鼠取尾血后,在28±2℃水浴中游泳1h,泳后1~1.5h,再次取尾血分離血清,4℃冰箱保存,用于游泳后血清尿素氮測定。存活小鼠繼續喂養。運動耐力測定:將小鼠置于28℃±2℃水浴中游泳,直至全部淹死為止,記錄每只小鼠游泳持續時間(致死時間)。血清尿素氮增量測定:血清中尿素在氨基硫脲存在下,與二乙酰一肟在酸性溶液中混合加熱,經Fe3+的催化縮生成3-羥-5,6-二甲基和1,2,4-三嗪紅色化合物,其顏色深淺與尿素含量呈正比。將樣品與試劑混勻后,置于沸水浴中10min,取出用流水冷卻,以520nm波長或綠色濾光片比色,用空白管調零,讀取測定管及標準管的吸光光度值,按下列公式計算:血清尿素氮(mmol/L)=測定管吸光度/標準管吸光度×0.375×1000×0.2×0.1泳后泳前差值即為血清尿素氮增量。1.3.2飼料配方的制備采血及飼喂方法:實驗小鼠先按常規方法飼喂一周,使適應環境,減少應激反應帶來的不便和實驗誤差。一周后對小鼠采取尾血分離血清,4℃冰箱保存,用于測定飼喂樣品前血清中總膽固醇的含量。次日開始飼喂樣品(飼喂劑量同1.3.1),連續飼喂10d。試驗第11d,再次采尾血分離血清,4℃冰箱保存,用于測定飼喂樣品后的血清中的總膽固醇的含量。膽固醇測定方法:血清經無水乙醇處理,蛋白質被沉淀,膽固醇及其酯則溶在無水乙醇中,在乙醇提取液中加磷硫鐵試劑(即濃硫酸和三價鐵溶液),膽固醇及其酯與試劑形成較穩定的紫紅色化合物,呈色程度與膽固醇及其酯含量成正比,可用比色法(560nm)定量測定。1.4本品系提取的解毒實驗方法1.4.1飼料及實驗設計實驗動物:昆明種小白鼠;性別和數量:20只,雌雄各半;動物年齡:7周齡;動物體重:18~22g;實驗環境和條件:室溫23±2℃,濕度60±20%,自動通風,光照14h。飼料由第三軍醫大學實驗動物中心提供,自由攝食和飲用自來水,飲水每日換一次;禁食時間:給藥前禁食12~16h。實驗設計:依照我國衛生部頒發的《新藥審批辦法》和《新藥臨床前研究指導原則匯編》中有關規定。單次給藥預試驗結果如表1。劑量及分組:參考預實驗結果,設立10.0g/kg體重1個劑量組,共20只小白鼠,雌雄各半。供試品給予途徑及給藥容量:灌胃,給藥容量為0.5ml/10g體重。單次給藥,藥后立即觀察、記錄動物的中毒反應、死亡情況及時間,連續觀察14d。1.4.2茶樹葉片細菌活性檢測試劑:陽性對照組:直接誘變劑絲裂霉素C(mitomycinC,MMC)(0.5μg/皿)、四硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline1-oxide,4-NQO)(0.5μg/皿)和正定霉素(40μg/皿);間接誘變劑2-氨基芴(60μg/皿);均系Sigma化學試劑公司產品,4℃保存。菌株:選用組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102,由美國加州大學Ames.BN教授惠贈。菌株保存方式:液氮冷凍保存。菌株增菌培養:將細菌接種在肉湯培養基中,在37℃,空氣振蕩(100~120r/min)條件下連續培養約10h。菌株遺傳特性:TA97、TA98、TA100和TA102四株測試菌株除具有組氨酸合成缺失突變外,還具有細胞壁脂多糖缺失突變和含有抗性R因子,前者可增加受試物滲透進入細胞的能力,而后者使細菌產生氨基芐青霉素抗性并增加檢測的敏感性。另外,TA97、TA98和TA100三菌株還具有切除修復系統缺失突變(紫外線敏感),而TA102則具有四環素抗性因子。大鼠S9活化系統的制備:大鼠誘導采用苯巴比妥酸和β-奈黃酮聯合誘導方法,雄性大鼠體重180~220g,腹腔注射誘導劑,5d后殺鼠制備肝勻漿。肝勻漿的制備:將大鼠斷頭處死,75%乙醇皮毛消毒,開腹取出肝臟稱重,將肝組織剪碎后,用0.15mol/LKCl溶液洗滌4~5次。以每克肝重加3ml0.15mol/LKCl溶液的比例將肝組織放入勻漿器中制成勻漿,9000g離心10分鐘,取其上清夜(S9)分裝塑料管(2ml/管)。液氮或-75℃冰箱冷凍保存。每毫升S9混合液組成如下:0.1mlS9;8μmolMgCl2;33μmolKCl;5μmolG-6-P;4μmolNADP;0.5ml磷酸緩沖溶液(pH7.4)。S9混合液在臨用前配制。誘變性試驗方法:誘變性實驗采用平皿摻入試驗保溫法。將0.1ml供試品溶液或溶媒、0.1ml增菌液和0.5ml磷酸緩沖溶液(pH7.4,0.2mol/L)或0.5mlS9混合液加入無菌試管(13×100mm)內,37℃振蕩培養20min,振蕩頻率約120r/min,然后向試管中加入2ml融化的頂層瓊脂(頂層瓊脂加入前維持45℃水浴中)。振蕩混懸管中成分后,鋪至基礎培養基平皿表面。待頂層瓊脂凝固后,將平皿倒置放入培養箱中,37℃培養約48h。每測試濃度在活化和非活化條件下各作三個平皿,重復試驗一次。最終結果取兩次試驗結果的平均值。分組:普洱茶特征成分提取物設5000、1000、100、10μg/皿和1μg/皿五個測試濃度。設空白對照,S9對照及陽性誘變劑對照。直接誘變劑為0.5μg/皿MMC、0.5μg/皿4-NQQ(TA97、TA100),40μg/皿正定霉素(TA98),間接誘變劑2-氨基芴(60μg/皿)。菌落計數:顯微鏡下確定細菌背景菌苔生長良好,與溶劑對照相比無明顯稀疏的條件下進行回變菌落計數,用自動菌落計數儀計數。結果觀察與判斷:采用沙門氏菌誘變性實驗預培養試驗方法,在加S9活化和非活化兩種條件下進行試驗。每測試點做三個平行樣本,并重復試驗一次。實驗設空白對照、S9對照及相應的陽性對照。再確認細菌背景生長良好的條件下,計數回變菌落數。如供試品引起的回變菌落數超過對照組一倍以上,并有劑量反應關系時,判斷供試品誘變實驗陽性,否則是陰性。統計分析:對數據進行方差分析。1.4.3普洱茶特征成分提取物、大鼠骨髓細胞微測試1.4.4體外誘變劑、藥物作用時間及染色體畸變試驗細胞:中國倉鼠肺細胞CHL(ChineseHamsterLungFibroblast,CHL),經鑒定細胞核型穩定,無支原體污染。細胞來源:衛生部藥檢所;保存方式:細胞貯存液態氮中。細胞培養條件:細胞培養用RPMI-1640培養基,放入37℃、5%CO2培養箱中培養。制備,貯存在-86℃超低溫冰箱中。采用苯巴比妥鈉和β-奈黃酮聯合誘導方法劑量:通過細胞毒性試驗以及直線回歸法計算細胞存活率50%細胞生長抑制濃度,IC50=5000μg/ml。據表2的結果,本試驗選擇5000、2500、1250μg/ml和500μg/ml四個劑量組。生理鹽水對照及S9混合液0.5ml分別為陰性對照;直接誘變劑絲裂霉素C(MMC)0.25μg/ml及間接誘變劑環磷酰胺(CP)20μg/ml,分別為陽性對照。代謝活化:為彌補傳代培養細胞沒有代謝活化系統,用苯巴比妥鈉和β-奈黃酮聯合誘導大鼠肝微粒體酶進行體外代謝活化試驗。藥物作用時間:在無代謝活化條件下,藥物與細胞作用24h及48h收獲細胞。有代謝活化條件下,藥物、S9混合液與細胞作用6h,洗滌、換液,于給藥后24h及48h收獲細胞。標本制作時間:藥物與細胞作用24h及48h收獲細胞,制作標本。鏡檢:每一濃度在油鏡下分析100個中期分裂相。分別記錄染色體數目及結構畸變。結果判定:參照《新藥(西藥)臨床前研究指導原則》。2結果與分析2.1本普洱茶提取物的生理作用2.1.1茶樹活性成分提取物對小鼠血清尿素氮、運動公信力的影響抗疲勞作用主要與人或動物體內蛋白質和含氮化合物的分解、形成血清尿素氮的形成速度有關。抗疲勞物質能有效地減少體內蛋白質和含氮化合物的分解,降低血清尿素氮的形成,提高肝糖原和肌糖原的貯備能力,從而提高機體的耐力和速度。用小鼠作動物模型,抗疲勞物質還能明顯延長實驗小鼠在水中游泳存活時間。本試驗通過測定實驗小鼠血清尿素氮增量及實驗小鼠在水中游泳存活時間、來確定普洱茶特征成分提取物和普洱茶水浸液的抗疲勞作用能力。圖1表示游泳前后小鼠血清尿素氮含量的變化。從圖1可以看出,普洱茶特征成分提取物組小鼠泳前泳后的血清尿素氮增量最小,普洱茶水提取物居中,對照組小鼠泳前泳后的血清尿素氮增量最大。小鼠運動耐力(致死時間)測定結果也表明,普洱茶特征成分提取物組小鼠游泳時間持續391.5±68.2min(n=4),顯著高于普洱茶水提取物組小鼠(252±67.3min,n=4)和對照組小鼠(250.5±68.7min,n=4)。抗疲勞試驗結果表明,由茶褐素、茶多糖和蛋白質組成的復合體的抗疲勞效果較普洱茶水提取物的效果顯著,而普洱茶水提取物的抗疲勞效果在本試驗中并不顯著。試驗結果還表明,普洱茶抗疲勞作用并非完全由咖啡堿所引起,而茶褐素、茶多糖以及茶蛋白等組成的復合體同樣具有抗疲勞作用。但具體是何成分起作用,正在研究之中。2.1.2加味加熱對血清膽固醇含量的影響許多流行病學研究均證明血清膽固醇水平與冠心病發病率有聯系,降脂藥物均有副作用,不利于長期使用,且中止服藥后血脂迅速上升,因此必須注意飲食治療。本實驗用比色法測定血清膽固醇含量,計算實驗動物飼喂樣品前后的血清膽固醇含量差值,而判斷普洱茶特征成分提取物和普洱茶水浸液的降膽固醇作用。試驗結果見圖2。從圖2可知,飲用普洱茶特征成分提取物比飲用普洱茶水提取液的降膽固醇效果更好,與對照(蒸餾水)相比,達顯著水平。由于茶褐素、茶多糖在普洱茶發酵過程中均大幅度增加,這為普洱茶奠定了良好的品質基礎。2.2本產品提取物的毒性評價由于普洱茶特征成分提取物具有較好的保健作用,為了更好地開發利用普洱茶特征成分,我們評價了普洱茶特征成分提取物的毒理學。2.2.1小鼠單次灌胃加熱實驗普洱茶特征成分提取物的小鼠經口急性毒性試驗表明,小鼠無明顯抑制性癥狀,如活動減少、伏臥不動等。個別小鼠有嚴重中毒癥狀。按照《新藥臨床前研究指導原則匯編》之規定,本實驗連續觀察14d。小鼠單次灌胃普洱茶特征成分提取物(20.0g/kg)后,死亡均發生在第一天,20只小鼠中有1只死亡,第二天起小鼠活動自如,皮毛光滑,未再出現死亡,存活動物體重無明顯變化。選用1993年7月衛生部藥政司頒布的《新藥臨床前研究指導原則匯編》中推薦的Bliss法,在微機上運行《藥理學計算與程序》之P33計算LD50及其95%可信限:LD50為>10g/kg體重。2.2.2細菌回復突變實驗鼠傷寒沙門氏菌誘變性實驗是目前廣泛應用的致突變性試驗方法,具有快速、靈敏的特點,其結果對于評價供試品的遺傳毒性具有重要價值。普洱茶提取物在S9活化和非活化兩種測試條件下,1~5000μg/皿測試濃度范圍內,誘發TA97、TA98、TA100和TA102產生的回變菌落數與陰性對照組相比均無明顯增加。上述結果表明在1~5000μg/皿測試濃度范圍內,普洱茶提取物對TA97、TA98、TA100和TA102四種測試菌株均無致基因突變作用(見表3)。直接誘變劑MMC(0.5μg/皿)、4-NQQ(0.5μg/皿)和正定霉素(40μg/皿)和間接誘變劑2-氨基芴(60μg/皿),在相應試驗條件下,誘發四菌株產生的回變菌落數均超過陰性對照組兩倍以上,表明所用實驗系統可靠。2.2.3加樣對骨髓嗜多染紅細胞的微核試驗檢測小鼠普洱茶特征成分提取物5.0g/kg灌胃給藥后12、24、36、48h和72h,對骨髓嗜多染紅細胞的微核率無明顯影響(見表4)。根據上述結果,選定取材時間為給藥后24h。普洱茶特征成分提取物5.0、1.0、0.5g/kg和0.1g/kg四個劑量組給藥后24h,對骨髓嗜多染紅細胞的微核率無明顯影響(見表5)。各組微核率分別為2.67±1.11‰、2.00±1.15‰、3.00±1.00‰和2.17±1.34‰,與溶劑對照組1.67±0.75‰相比較,P>0.05,無顯著性差別。而環磷酰胺(CP)陽性對照組微核率高達30.0±2.0‰,與溶劑對照組相比較,經統計學檢測差異非常顯著(P<0.01),表明本系統可靠。說明在本實驗條件下,普洱茶特征成分提取物對昆明種小鼠無致骨髓細胞微核形成作用。2.2.4茶樹幼苗對chl細胞染色體畸變率的影響CHL染色體畸變試驗目前廣泛應用的致突變試驗方法,具有快速、靈敏的特點,其結果對于評價樣品的遺傳毒性具有重要價值。在本試驗中,無論是24h及48h收獲細胞進行染色體畸變分析,空白對照、溶劑對照、S9混合液對照染色體畸變率在正常范圍(見表6),在S9活化和非活化兩種測試條件下,普洱茶特征成分提取物在500~5000μg/ml濃度范圍內染色體畸變率也在正常范圍,因此,在本試驗系統條件下,普洱茶特征成分提取物在500~5000μg/ml濃度范圍內未見誘發CHL細胞染色體畸變率增高。直接誘變劑絲裂霉素C(MMC,0.25μg/ml)染色體畸變率顯著增高。間接誘變劑環磷酰胺(CP,20μg普洱茶特征成分提取物/ml)無S9混合液時染色體畸變率在正常范圍,有S9混合液時染色體畸變率顯著增高,表明本試驗系統可靠。3加標對小鼠骨髓細胞微核試驗小鼠實驗系統:昆明種小白鼠;性別和數量:雄性,每組6只;年齡:40日齡;體重:19~22g;小白鼠每籠5只,室溫25±5℃,濕度80±10%,自動通風,光照14h。自由飲用自來水,每日換一次。試驗設計:試驗設計依據為