人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)在基因打靶中的應(yīng)用

固定復(fù)雜的分組是生物基礎(chǔ)研究和臨床治療的重要價值。20世紀(jì)80年代末誕生了第一個基因敲除的小鼠(Musmusculus)模型,科研工作者從此能夠選擇性地修改載有生命密碼的基因組,探討基因的功能。遺憾的是,在隨后的20余年時間里,基因組靶向修飾技術(shù)僅限于能夠在小鼠、果蠅(Drosophilamelanogaster)等極少數(shù)幾個物種中實現(xiàn)。在這期間,人們始終在設(shè)法尋求具有普適性的新的基因定點突變方法。近幾年,人工核酸內(nèi)切酶(Engineeredendonuclease,EEN)技術(shù)的出現(xiàn)與完善使這個夢想逐步變成了現(xiàn)實。EEN是通過基因工程的方法,將特定的DNA結(jié)合蛋白跟特定的核酸內(nèi)切酶相互融合構(gòu)建而成的一種人造蛋白,它目前主要包括3種類型:鋅指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN),以及人工的大范圍核酸酶(Meganuclease)。EEN主要包含兩個結(jié)構(gòu)域,一個是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,用來特異識別并結(jié)合特定的DNA靶序列;另一個是DNA切割結(jié)構(gòu)域,用來切割DNA靶序列,造成DNA雙鏈斷裂(Double-strandbreak,DSB)。DSB能夠激活細(xì)胞內(nèi)固有的非同源末端連接(Non-homologousendjoining,NHEJ)或同源重組(Homologousrecombination,HR)機(jī)制,對這種DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。其中NHEJ是一種較為簡單的修復(fù)方式,但是保真度不高,很容易造成DNA斷裂處的序列發(fā)生改變,產(chǎn)生DNA的小片段插入和/或缺失(indel),進(jìn)而造成基因突變。在存在同源序列的情況下,還可以通過HR的方式進(jìn)行修復(fù),不過效率相對較低。有報道DSB能提高同源重組介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的頻率。根據(jù)上述特性,NHEJ途徑和HR途徑在理論上都可以用于對感興趣的目的基因進(jìn)行遺傳改造。ZFN是第一種人工構(gòu)建并成功應(yīng)用的EEN,迄今已經(jīng)發(fā)展了16年,這要?dú)w功于人們對于鋅指轉(zhuǎn)錄因子和FokⅠ核酸內(nèi)切酶的深入了解。雖然ZFN的出現(xiàn)大大促進(jìn)了基因組靶向修飾技術(shù),但是,由于鋅指基序(motif)同其靶序列的對應(yīng)性并不特異,對于每一個特定的靶點,往往需要構(gòu)建龐大的鋅指表達(dá)文庫,通過實驗篩選出高效且特異結(jié)合靶序列的鋅指蛋白;而且在基因組上找到合適的ZFN靶點也比較困難。事實上,雖然人們已經(jīng)開發(fā)出多種篩選方法,但是獲得有效的ZFN仍然是一個相當(dāng)大的技術(shù)難題。因此,人們一直希望能找到新的、核酸靶序列與蛋白質(zhì)的motif之間對應(yīng)性更強(qiáng)、便于預(yù)測的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。幸運(yùn)的是,2009年,有兩個研究組同時報道,類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(Transcriptionactivator-likeeffector,TALE)就是這樣一類理想的蛋白質(zhì)。迄今僅短短3年的時間,基于TALE結(jié)構(gòu)的人工核酸內(nèi)切酶已經(jīng)被成功地應(yīng)用于包括芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蠅、斑馬魚(Daniorerio)、線蟲(Caenorhabditiselegans)、大鼠(Rattusnorvegicus)、水稻(Oryzasativa)、蟋蟀(Gryllusbimaculatus)、家蠶(Bombyxmori)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)與熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、豬(Susscrofa)和牛(Bostaurus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)在內(nèi)的多個物種,以及體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞(包括人類細(xì)胞)(圖1)。TALEN既能夠像ZFN一樣精確地修飾復(fù)雜的基因組,又具有比ZFN更容易設(shè)計的優(yōu)點,對于遺傳學(xué)的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究來說,無疑都是一個重大的飛躍。由于在TALEN組裝技術(shù)和模式動物應(yīng)用上的突破,EEN介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在2012年1月被NatureMethods雜志評選為2011年度最受矚目、最有影響力的年度生命科學(xué)技術(shù);2012年12月被Science雜志評為2012年度十大科學(xué)進(jìn)展之一。Science在評述中把TALEN稱為基因組的“巡航導(dǎo)彈”,還大膽預(yù)測TALEN技術(shù)將成為所有分子生物學(xué)實驗室都要掌握的基本實驗技能。本文將從TALEN的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建及其在基因組定點修飾中的應(yīng)用等方面介紹TALEN的研究進(jìn)展。1tale蛋白的結(jié)構(gòu)TALE蛋白家族來自一類特殊的植物病原體——黃單胞桿菌(Xanthomonasspp.)。早在1989年,人們就發(fā)現(xiàn)了該家族的第一個成員AvrBs3。TALE蛋白類似于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子,它可以通過識別特異的DNA序列調(diào)控宿主植物內(nèi)源基因的表達(dá),從而提高宿主對該病原體的易感性。不過,直到20年后,人們才揭開了TALE與其靶位點相互識別的奧秘。TALE蛋白N端一般有轉(zhuǎn)運(yùn)信號(Translocationsignal),C端有核定位信號(Nuclearlocalizationsignal,NLS)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activationdomain,AD),而中部則是介導(dǎo)其與DNA特異識別與結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。TALE蛋白的中部包含一段很長的、串聯(lián)排列的重復(fù)序列,這種重復(fù)序列為這一蛋白家族所獨(dú)有,是其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個重要組成部分,具有特異性識別并結(jié)合特異DNA序列的特性。其序列重復(fù)的部分由1到33個長度為33~35個氨基酸殘基的重復(fù)單位(或稱重復(fù)單元)串聯(lián)后,再加上末尾(C端)的一個含有20個氨基酸殘基的半重復(fù)單位構(gòu)成。也就是說,TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一段連續(xù)的1.5~33.5個重復(fù)單位,其中每個重復(fù)單位以及末尾的半重復(fù)單位可特異地識別并結(jié)合一個特定的核苷酸靶位點。在每個重復(fù)單位中,+12和+13位的氨基酸殘基是實現(xiàn)靶向識別特異DNA堿基的關(guān)鍵位點,隨靶點核苷酸序列的不同而異,被稱作重復(fù)可變雙殘基(Repeatvariabledi-residue,RVD);其他位置的氨基酸殘基則相對固定。不同的RVD能夠相對特異地分別識別A、T、C、G4種堿基中的一種或多種,其中分別與這4種堿基相對應(yīng)的最常見的4種RVD分別是NI(AsnIle)、NG(AsnGly)、HD(HisAsp)和NN(AsnAsn)(圖2)。最近有兩篇文獻(xiàn)指出NH(AsnHis)作為一種RVD也能夠高效識別G堿基,并且比NN的特異性高。由此可見,TALE的重復(fù)單元跟靶序列具有很好的一一對應(yīng)性,因而在識別靶點的特異性方面比ZFN更有優(yōu)勢。2fki核苷酸內(nèi)切酶TALE的應(yīng)用中最引人注目的是TALE核酸酶(即TALEN)。研究人員首先嘗試的是仿照ZFN的模式,把TALE中的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)替換成核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建成TALE核酸酶,對基因組的特定靶位點進(jìn)行定向切割,從而實現(xiàn)基因打靶(圖2,圖3)。TALEN中通常使用的切割結(jié)構(gòu)域來自于無序列特異性的FokⅠ核酸內(nèi)切酶,FokⅠ的使用與優(yōu)化主要得益于ZFN的研究成果。需要說明的是,FokⅠ通常需要以二聚體的形式發(fā)揮其切割DNA序列的功能,因此,無論是ZFN還是TALEN,通常都是成對使用。理論上,TALEN技術(shù)適用于任意物種,對于那些尚無成熟的基因打靶技術(shù)的物種而言尤為重要。一個物種能否采用TALEN技術(shù)實現(xiàn)基因打靶(得到可遺傳的基因突變的個體)主要取決于兩個因素:一是是否有有效的方法把TALEN(表達(dá)載體或mRNA)導(dǎo)入該物種的細(xì)胞或卵/胚胎(常用的方法包括轉(zhuǎn)染、顯微注射、病毒感染等);二是該物種的種質(zhì)細(xì)胞/生殖細(xì)胞的基因組是否能夠有效地受到TALEN的作用,從而產(chǎn)生突變,并且把突變傳遞到下一代。上述這兩點實際上也是制備轉(zhuǎn)基因動物的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此,如果某個物種具備制備轉(zhuǎn)基因個體的方法,那么,通過借鑒轉(zhuǎn)基因的方法,這個物種應(yīng)該很容易用TALEN技術(shù)制備可遺傳的突變體。此外,TALEN跟體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合,應(yīng)該可以成為一條制備基因打靶大動物(豬、牛等)的有效途徑。3tali-nt選擇靶位點的原則TALEN應(yīng)用的首要問題是靶位點的選擇。2011年,Bogdanove和Voytas描述了選擇TALEN靶位點的原則:(1)TALEN靶位點5′端的前一位(第0位)堿基應(yīng)為胸腺嘧啶(T);(2)靶序列的第一位堿基(5′端堿基)不是胸腺嘧啶(T);(3)靶序列的第二位堿基不是腺嘌呤(A);(4)靶序列的最后一個堿基(3′端堿基)是胸腺嘧啶(T)(對應(yīng)于最后的0.5個TALE重復(fù)單元);(5)在TALEN靶位點中4種堿基各占一定比例。根據(jù)目前收集到的所有TALE蛋白的結(jié)構(gòu)信息,天然存在的TALE靶點的堿基組成為A=31±16%,C=37±13%,G=9±8%,T=22±10%。因此,潛在的TALEN靶位點的堿基組成應(yīng)盡量遵從A=0~63%,C=11~63%,G=0~25%,T=2~42%。2012年,隨著高通量TALEN合成技術(shù)FLASH(FastLigation-basedAutomatableSolid-phaseHigh-throughput)的產(chǎn)生,Joung實驗室對TALEN的活性進(jìn)行了大量的檢測與比較,結(jié)果顯示,TALEN靶位點選擇只需要遵從上述的第一條原則即可。這樣一來,對TALEN靶位點選擇的限制越來越少,這樣更有利于進(jìn)行基因組的靶向修飾。隨著更多TALE/TALEN相關(guān)論文的發(fā)表,人們對TALEN靶位點的選擇原則也將會有越來越清晰的認(rèn)識。為了便于利用TALEN開展研究工作,許多實驗室建立了公開的網(wǎng)站幫助研究人員預(yù)測/設(shè)計TALEN靶點。Bogdanove和Voytas實驗室最早建立了TALE-NT網(wǎng)站(/),利用該網(wǎng)站可以選擇兩側(cè)TALEN結(jié)合位點所含堿基數(shù)量(等于對應(yīng)的TALEN蛋白中所含RVD單元重復(fù)數(shù)量)及兩側(cè)位點間的間隔(Spacer)的長度范圍,該網(wǎng)站還會在預(yù)測結(jié)果中標(biāo)出Spacer中所含有的限制性酶切位點。TALE-NT支持用戶自行選擇是否遵從上述多條選擇TALEN靶位點的原則,或是只遵從第一條原則。Joung實驗室建立的ZiFiT網(wǎng)站(/ZiFiT/)需要用戶指定希望產(chǎn)生DSB的堿基,該網(wǎng)站會給出該堿基周圍的2對TALEN的預(yù)測序列。Zhu實驗室建立了idTALE網(wǎng)站(.sa/),除了支持在用戶提交的序列中進(jìn)行TALEN位點預(yù)測之外,還提供輸入擬南芥(TAIR10)、小立碗蘚(Phypa1.1)、線蟲(WS220)、果蠅(BDGP5.25)和釀酒酵母(EF3)這幾種模式生物的基因ID進(jìn)行直接搜索。4傳統(tǒng)質(zhì)粒載體的gate克隆策略當(dāng)TALE與DNA特異性識別的分子密碼被破解后,研究人員首先想到的是如何借鑒ZFN的策略,把天然的TALE加以改造,使其成為能夠?qū)μ囟ǖ幕蚪M位點進(jìn)行靶向突變和修飾的工具。為了保證靶點在整個基因組中存在唯一性,靶序列一般會選擇大于10bp。這樣,就要求TALE需要含有至少9.5個重復(fù)單元,編碼這一重復(fù)結(jié)構(gòu)的核苷酸長度就會大于1kb,并且序列的重復(fù)性很強(qiáng)。因此,構(gòu)建識別特定DNA序列的TALE就成為這一技術(shù)中的一個關(guān)鍵步驟和TALE應(yīng)用中的主要瓶頸,人們?yōu)榇税l(fā)明了多種方法來解決這一問題。目前,除了可以選擇全序列人工合成這一昂貴的方法之外,通過分子克隆的途徑人工構(gòu)建TALE的方法主要包括四大類:(1)基于GoldenGate(GG)克隆的方法:根據(jù)單體的不同來源可分為基于PCR的GG法(GG-PCR)和傳統(tǒng)的基于質(zhì)粒載體的GG法(GG-Vector);(2)基于連續(xù)克隆組裝的方法:包括限制性酶切-連接法(Restrictionenzymeandligation,REAL)、單元組裝法(Unitassembly,UA)和idTALE一步酶切次序連接法;(3)基于固相合成的高通量方法:包括FLASH和ICA(Iterativecappedassembly);(4)基于長粘末端的LIC(Ligation-independentcloning)組裝方法等(表1,圖4)。Zhang等最早把GoldenGate克隆的策略應(yīng)用到TALE重復(fù)單元的構(gòu)建,建立了GG-PCR法。他們利用了每兩個相鄰的TALE重復(fù)單元交界處的Gly-Leu雙氨基酸殘基的編碼序列的簡并性。有4個密碼子編碼Gly,6個密碼子編碼Leu,因此一共可以有4×6=24種不同的密碼子(核苷酸序列)組合編碼這兩個氨基酸殘基。這樣就可以人為設(shè)計出24種不同的TALE重復(fù)單元的交界序列,作為相互特異連接的粘末端和構(gòu)建特異結(jié)合引物的位點。在具體實驗中,他們先使用多對特異識別不同片段的PCR引物分別擴(kuò)增出每一種TALE重復(fù)單元(對應(yīng)于在某個特定位置的某種特定的核苷酸靶點,例如第2位的T、第3位的A等),并在擴(kuò)增的同時通過引物引入IIS類內(nèi)切酶的識別位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)IIS類內(nèi)切酶切割后,識別位點本身被切除,同時在每個片段兩端各留下一個5′凸出的4堿基粘性末端,每4個(改進(jìn)后為6個)相鄰的重復(fù)單元的粘性末端是依序彼此匹配的,連接后可得到多組四聯(lián)(或六聯(lián))重復(fù)單元。然后用能夠分別與四聯(lián)(或六聯(lián))重復(fù)單元中的第一個和最后一個單元特異結(jié)合的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(同時再次引入IIS酶切位點),再次將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切-連接,可將四聯(lián)(或六聯(lián))重復(fù)單元相互連接成更長的片段。重復(fù)上述PCR擴(kuò)增、酶切、連接的過程,直到得到指定的長度(重復(fù)單元數(shù)),最后再將最終的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物整體連入帶有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或DNA切割結(jié)構(gòu)域的目的載體中。隨后,在NucleicAcidsResearch雜志上接連發(fā)表了3篇、在PLoSOne上連續(xù)發(fā)表了兩篇基于傳統(tǒng)質(zhì)粒載體的GoldenGate克隆策略(GG-Vector法)。以Yang實驗室的GoldenGate克隆策略為例,他們利用了TALE重復(fù)單元中+18和+19位氨基酸殘基Ala-Leu的密碼子簡并性,GC(A/T/C/G)(T/C)TG這8種密碼子組合都能編碼這種雙氨基酸殘基,藉此構(gòu)建了一系列含有編碼上一重復(fù)單元+18位到本重復(fù)單元+19位氨基酸殘基序列的質(zhì)粒(分別編碼4種對應(yīng)于不同堿基靶點的RVD以及8種簡并密碼子,共32個),并在緊鄰這一編碼區(qū)域外側(cè)的質(zhì)粒骨架上設(shè)計一個IIS類限制性核酸內(nèi)切酶BsmBⅠ的識別位點。經(jīng)BsmBⅠ酶切后,每個質(zhì)粒可產(chǎn)生一個帶有4堿基凸出的5′粘性末端。依序選擇帶有所需RVD的、粘末端依次匹配的模塊,并加入跟第一個模塊前端及第八個模塊后端的粘末端匹配的質(zhì)粒骨架,混合在一起進(jìn)行連接反應(yīng),即可組裝得到八聯(lián)子重復(fù)序列。再經(jīng)過第二次酶切、連接,即可獲得識別16個或24個堿基的TALE重復(fù)序列。REAL方法由Joung實驗室建立,他們使每個TALE基本單元質(zhì)粒的5′端都帶有ⅡS型內(nèi)切酶BbsⅠ的識別位點,3′端都帶有另一個ⅡS型內(nèi)切酶BsaⅠ和普通內(nèi)切酶BamHⅠ的識別位點。組裝時,使用BsaⅠ和BamHⅠ雙酶切前一個單元,產(chǎn)生一個序列特異的4bp粘性末端和一個序列固定的粘性末端(由BamHⅠ產(chǎn)生);同時,使用BbsⅠ和BamHⅠ雙酶切后一個單元,產(chǎn)生一個跟前一個單元互補(bǔ)的序列特異的4bp粘性末端和一個序列固定的BamHⅠ粘性末端,兩個片段連接后可形成TALE雙單元。這樣形成的雙單元質(zhì)粒中仍然具有BbsⅠ、BsaⅠ和BamHⅠ3個酶切位點,可用于重復(fù)進(jìn)行上述的酶切-連接過程,構(gòu)建更長的重復(fù)序列。如此循環(huán)進(jìn)行酶切—連接反應(yīng),即可構(gòu)建出指定長度的TALE重復(fù)序列。REAL-Fast方法是REAL的改進(jìn)版本,它將REAL方法中的16種質(zhì)粒(4種不同的RVD、4類不同的粘性末端)預(yù)先組裝為二、三、四聯(lián)子,一共得到384個質(zhì)粒,以增加儲備質(zhì)粒的代價減少酶切-連接組裝的步驟。Zhu實驗室構(gòu)建了一個含有100種不同的TALE重復(fù)片段的質(zhì)粒庫,其中的RVD單元來自天然的dHax3TALE蛋白,也是利用ⅡS內(nèi)切酶和普通內(nèi)切酶相結(jié)合的方式通過連續(xù)的酶切和連接構(gòu)建TALE重復(fù)序列。FLASH方法采用的質(zhì)粒材料和REAL-Fast相同,不過改用了在96孔板中的固相基質(zhì)中進(jìn)行酶切、連接,這樣就可以省略每一次酶切-連接之后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化和生長這一耗時的中間步驟,從而能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高通量地構(gòu)建TALE重復(fù)序列。ICA是另一種固相合成的方法,其原理與FLASH類似,不過在每一步延伸連接的步驟中除了加入能跟上一步中間產(chǎn)物的末端相匹配的待連接片段之外,還采取了同時加入跟上上步的中間產(chǎn)物的末端相匹配的封閉片段的策略,以便減少不完全連接或錯誤連接的發(fā)生。LIC組裝方法是設(shè)計多種TALE多單元片段,使其兩端都帶有較長的單鏈末端突出堿基(不少于10個堿基),這種帶有長的片段復(fù)性后可以直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌,不需要經(jīng)過連接的步驟;將序列彼此互補(bǔ)的多個長粘性末端的片段混和在一起,經(jīng)退火處理后直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌,就可以一步得到所需的TALE重復(fù)序列載體。以上這些構(gòu)建TALE重復(fù)序列的方法均存在一定的缺點:(1)基于GoldenGate的方法構(gòu)建TALE一般都需要預(yù)先合成大量并且相似的質(zhì)粒和引物,例如,GG-PCR法需要用到24條引物;GG-Vector法的每一位靶點都需要構(gòu)建4種載體,分別對應(yīng)4種可能的堿基;但是這4種載體中TALE重復(fù)單元的兩端都需要帶有相同的ⅡS型限制性內(nèi)切酶的酶切位點,以便酶切后產(chǎn)生序列相同的粘性末端。如果標(biāo)注不夠清晰,質(zhì)粒或引物之間很容易相互混淆。在連接反應(yīng)中,只要有一個載體或引物出現(xiàn)問題(例如選用了錯誤的載體或引物),這個連接反應(yīng)就會失敗,或者得到錯誤的TALE重復(fù)序列。如果連接失敗,不僅得不到連接產(chǎn)物,而且也很難判斷是哪一個載體或引物有問題。(2)ⅡS類內(nèi)切酶并非常用的酶,價格相對比較高。(3)FLASH和ICA技術(shù)雖然能高通量、快速地合成TALE重復(fù)序列,但是該項技術(shù)需要特殊的設(shè)備和試劑,并且FLASH往往需要通過一定規(guī)模的測序才能找到正確的連接終產(chǎn)物,同時也需要預(yù)先準(zhǔn)備大量質(zhì)粒片段。這類方法更適用于需要一次性大規(guī)模構(gòu)建TALEN載體的實驗室。(4)LIC所需的TALE長粘末端片段數(shù)量繁多并且序列復(fù)雜,例如,如果要構(gòu)建整套的2單元TALE片段,各種粘末端接頭的組合就有64種。“單元組裝法”是本實驗室建立的一種合成TALE重復(fù)單元的簡便方法,其獨(dú)特之處在于采用了“替代重復(fù)單元”(或稱“旁重復(fù)單元”,alternativerepeatunit),從而能夠利用氨基酸密碼的簡并性在這種重復(fù)單元的兩端設(shè)計一對同尾酶(5′端SpeⅠ和3′端NheⅠ)的酶切位點,再加上一個輔助性的HindⅢ位點,這樣就可以用相同的酶切策略、通過酶切-連接的循環(huán)操作構(gòu)建任意長度的重復(fù)序列。例如,如果要構(gòu)建識別AT雙核苷酸的TALE雙單元載體,可以用NheⅠ+HindⅢ雙酶切識別A的單一單元模塊載體,得到包含A單元的載體骨架長片段;用SpeⅠ+HindⅢ雙酶切識別T的單一單元模塊載體,得到包含T單元的短片段。將兩者連接到一起,就可以構(gòu)建出識別AT的雙單元模塊載體。由于SpeⅠ和NheⅠ為同尾酶而非同裂酶,由它們分別產(chǎn)生的兩個粘性末端序列互補(bǔ),可以相互連接,但是連接在一起后兩個酶切位點均消失,而不能再被這兩個酶切割。因而新構(gòu)建出的雙單元模塊載體中只保留了雙單元5′端的SpeⅠ和3′端的NheⅠ酶切位點。這與單一單元模塊的酶切位點結(jié)構(gòu)完全一致。這樣,就可以用兩個雙單元模塊載體重復(fù)上述酶切-連接的步驟,得到四單元模塊;或者使用一個單一單元模塊載體和一個雙單元模塊載體通過類似的步驟,得到三單元模塊。依此類推,不斷重復(fù)上述酶切—連接的步驟,即可構(gòu)建出任意所需的TALE重復(fù)單元數(shù)(詳見本期另文發(fā)表的實驗指南“TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點突變的實驗方法與流程”)。“單元組裝法”的特點在于:(1)所需的起始載體數(shù)量少:所有的TALE重復(fù)序列都可以從最基本的4個單一單元模塊開始構(gòu)建;(2)載體具有累積效應(yīng):所有的中間載體(例如16種二單元、64種三單元和256種四單元模塊載體)都可以保存下來、用于構(gòu)建其它的TALE,使后續(xù)的載體構(gòu)建變得越來越方便、快捷;(3)精確度和保真性好:不需要通過大量測序來篩選正確的克隆;(4)成本較低:只需要SpeⅠ、HindⅢ和NheⅠ這3種普通的常用限制性內(nèi)切酶,成本相對較低,并且質(zhì)量和活性有保證;(5)方法簡單、技術(shù)難度低:只需要最基本的分子生物學(xué)知識就可以操作,不需要特殊的設(shè)備和試劑。因此,對于任意實驗室,只要掌握了常規(guī)的分子克隆操作技術(shù),就能很快掌握并應(yīng)用這個方法。。5tale在fkisb中的應(yīng)用在TALE重復(fù)單元的構(gòu)建方法不斷豐富的同時,TALE和TALEN技術(shù)的應(yīng)用也迅速展開。2010年6月,Voytas實驗室利用AvrBs3和PthXo1中天然存在的TALE重復(fù)序列分別跟FokⅠ融合,首次報道這種人工構(gòu)建的TALEN可以切割目標(biāo)DNA。由于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與切割結(jié)構(gòu)域之間的距離會影響到DNA靶位點中左側(cè)和右側(cè)TALE識別序列之間的距離(這兩個識別位點之間的序列間隔稱為Spacer),該論文在TALE重復(fù)單元區(qū)域之后保留了C末端235個氨基酸殘基與FokⅠ結(jié)構(gòu)域相連,研究了Spacer跟TALEN活性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,對于這兩個結(jié)構(gòu)域之間這種長度的過渡序列,兩個靶序列的間距應(yīng)控制在13~30bp之間,其中15bp的效果最好。Yang實驗室用來自AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重復(fù)序列進(jìn)行了類似的實驗,并比較了將FokⅠ結(jié)構(gòu)域連接到TALE結(jié)構(gòu)域不同末端(N端或C端)構(gòu)成的TALEN融合蛋白的效果。結(jié)果顯示,FokI連接到TALE的C端時效率更高。2010年底,Sangamo公司首次報道利用全序列人工合成的TALE重復(fù)序列跟FokI的核酸酶結(jié)構(gòu)域形成TALEN融合蛋白,在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞系HEK293和K562中分別對NTF3和CCR5等兩個內(nèi)源基因成功進(jìn)行了定點突變。該論文同時報道,TALE重復(fù)單元數(shù)從9到24都可以跟目標(biāo)DNA結(jié)合,其中16和18的效率較高;重復(fù)序列跟FokⅠ之間的距離(即保留來自TALE蛋白C末端區(qū)域的肽段的長度)范圍可以為28~95個氨基酸殘基,其中63個氨基酸殘基的效率較高;而對于這種保留63個氨基酸殘基的TALEN骨架(被稱為“+63”骨架),靶位點中左側(cè)和右側(cè)兩個半位點(Half-site,即單側(cè)TALE的識別/結(jié)合序列)之間的DNA序列間隔(Spacer)可以在12~20個堿基之間。此后,自2011年起,TALEN迅速在多個物種中(絕大部分在個體水平)成功應(yīng)用(表2)。Yang實驗室利用TALEN成功地通過NHEJ和同源重組兩種方式突變了芽殖酵母的多個內(nèi)源基因。隨后,Meyer實驗室利用TALEN在線蟲中誘導(dǎo)ben-1基因產(chǎn)生突變,首次在多細(xì)胞物種中實現(xiàn)了TALEN介導(dǎo)的基因打靶。2011年8月,Jaenisch實驗室報道通過TALEN在人的誘導(dǎo)多潛能細(xì)胞(iPSC)和ES細(xì)胞中可以實現(xiàn)同源重組介導(dǎo)的基因敲入,其效率跟ZFN類似;Anegon實驗室利用TALEN突變了大鼠的IgM基因;Yeh實驗室和Joung實驗室利用REAL法構(gòu)建的TALEN在斑馬魚體細(xì)胞中得到了hey2和gria3a的突變,突變效率從11%到33%;本實驗室同時報道利用單元組裝法構(gòu)建的TALEN對tnikb和dip2a兩個基因成功打靶,并且獲得了可以穩(wěn)定遺傳的斑馬魚突變體。2012年,Langenau實驗室報道在斑馬魚中TALEN產(chǎn)生突變的效率比ZFN高,Ekker實驗室及合作者共同報道,借助于TALEN產(chǎn)生的DSB,能夠把短的單鏈DNA(Single-strandedDNA,ssDNA)(包含loxP序列)精確重組到斑馬魚的基因組中,為開展條件性基因打靶工作奠定了必要的技術(shù)基礎(chǔ)。同時,TALEN技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)展到了更多的物種:Zhu實驗室利用TALE-SRDX抑制擬南芥基因的表達(dá);Ying實驗室在大鼠細(xì)胞中利用TALEN技術(shù)實現(xiàn)了對BMPR2基因敲除;Jiao實驗室在果蠅中利用TALEN成功得到可以通過種系遺傳的yellow基因突變;Yang實驗室利用TALEN技術(shù)在水稻中敲除了Os11N3基因;Mito實驗室利用TALEN技術(shù)成功地對蟋蟀的基因進(jìn)行了定點突變;Xia實驗室利用2對TALEN在家蠶中對BmBlos2基因?qū)崿F(xiàn)了800bp的染色體片段刪除;Sangamo公司在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中利用TALEN敲除了FUT8基因;Zhao實驗室報道利用TALEN在兩種爪蟾中成功實現(xiàn)了基因敲除;Fahrenkrug實驗室則在牛和豬中實現(xiàn)了TALEN介導(dǎo)的基因敲除。6pcr擴(kuò)增后凝膠電泳使用TALEN對基因組進(jìn)行定點修飾的方案跟ZFN類似,主要是基于NHEJ和HR的各種應(yīng)用。在TALEN的應(yīng)用中,如何進(jìn)行活性或突變效率檢測是一個帶有普遍性的問題。目前,對于檢測體內(nèi)(invivo)NHEJ引起的indel發(fā)生的效率而言,常用的方法包括直接克隆測序法、限制性內(nèi)切酶(RE)酶切檢測法和基于可以識別錯配雙鏈的錯配內(nèi)切酶檢測法(主要采用CELI內(nèi)切酶和T7E1兩種酶)(圖6);檢測TALEN介導(dǎo)HR活性的方法則包括體外(invitro)的SSA(Singlestrandannealing)分析方法、體內(nèi)或體外引入報告基因的方法和直接PCR檢測重組是否發(fā)生的方法(后面兩種方法只能確定是否發(fā)生了切割和修飾,無法估算TALEN效率)。采用限制性內(nèi)切酶酶切檢測法檢測NHEJ引起的indel相對較為簡單易行。這種方法依據(jù)的原理是TALEN造成的indel突變往往會導(dǎo)致Spacer中原有的酶切位點被破壞。使用這種方法只需要在設(shè)計靶點時,選擇Spacer中帶有一個獨(dú)有的(Unique)限制性內(nèi)切酶位點的靶點。檢測時,提取基因組DNA在TALEN靶點兩側(cè)設(shè)計一對引物,通過PCR擴(kuò)增出涵蓋靶點區(qū)域的DNA片段(300~500bp為宜),用上述內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物并進(jìn)行凝膠電泳。野生型DNA應(yīng)該能夠被完全酶切,產(chǎn)生1~2個較短的條帶而經(jīng)TALEN處理過的樣品則會由于部分DNA的酶切位點發(fā)生改變而導(dǎo)致有一定比例的PCR產(chǎn)物未被切開(圖5)。將未切開的條帶回收后克隆測序,就可以檢測具體的突變類型。根據(jù)本實驗室的經(jīng)驗,電泳圖中未被切開的條帶的亮度(密度)占總條帶的比例一般能直接反映TALEN的活性/效率。如果靶點中沒有合適的酶切位點,則可以在PCR擴(kuò)增后直接克隆測序,檢測是否產(chǎn)生了一定比例的突變(克隆測序法)。不過,這種方法相對比較昂貴,如果TALEN活性不高,有可能需要測上百個克隆才能檢測到突變。錯配內(nèi)切酶檢測法主要是利用能特異性識別并切割雜合異源雙鏈的內(nèi)切酶。如果一個DNA樣品(PCR產(chǎn)物)中有一部分序列帶有inde突變,那么,該樣品經(jīng)變性—復(fù)性處理后將會形成一定比例的異源雙鏈DNA(例如一條野生型鏈和一條帶有indel的鏈雜交而成的雙鏈),出現(xiàn)錯配的區(qū)域。錯配內(nèi)切酶能夠特異識別并切割這些區(qū)域,在凝膠電泳圖上呈現(xiàn)為較短的條帶。常用的錯配識別酶有CELI內(nèi)切酶和T7E1等,其中CELI酶以Transgenomic公司的Surveyor試劑盒檢測法最為常用。SSA則是一種常用的體外檢測TALEN效率的方法,一般用CMV啟動子驅(qū)動的熒光素酶(Luciferase)作為報告基因。在報告載體上含有2個編碼區(qū)不完整(因而無功能的)、但包含有一段相互重疊的同源序列的熒光素酶編碼片段,2個片段之間被終止密碼子和TALEN目標(biāo)序列分隔開。如果TALEN能夠造成該目標(biāo)序列產(chǎn)生DSB,則DSB可誘導(dǎo)兩段同源序列之間發(fā)生重組,產(chǎn)生出完整的有功能的熒光素酶編碼序列,從而使熒光素酶的活性得以恢復(fù)。通過比較添加TALEN前后熒光素酶的活性變化,可以評估TALEN的活性。更多TALEN檢測方法的詳細(xì)介紹和使用范圍比較,可參見本實驗室建立的EENdb數(shù)據(jù)庫。7tali在斑馬魚基因組的應(yīng)用除了TALEN技術(shù)介導(dǎo)的基因組定點突變技術(shù)之外,TALE無疑還可以應(yīng)用于對基因組進(jìn)行其他的操作/調(diào)節(jié)。已有報道將TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其他蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(例如VP16或VP16的四聚衍生物VP64)或轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域融合,可分別激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄(表達(dá))。不難預(yù)見,TALE還應(yīng)該可以與甲基化結(jié)構(gòu)域等其他功能結(jié)構(gòu)域融合,從而實現(xiàn)甲基化基因組上的特定位點、研究表觀遺傳調(diào)控等等對基因組的其他定點操作。不過,通過用戶定制的TALEN隨意改造復(fù)雜的基因組,依然是TALE應(yīng)用中最為吸引人的。毋庸置疑,TALEN技術(shù)對基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和人類基因治療等諸多領(lǐng)域都會產(chǎn)生重大影響,堪稱基因組定點修飾技術(shù)的一場革命。它開辟了前所未有的方式來剖析任意物種的基因功能,還可以在同一個細(xì)胞系上利用TALEN技術(shù)產(chǎn)生不同的遺傳病模型,為人類遺傳病或后天的基因紊亂疾病開啟了新的治療途徑。而像斑馬魚這樣還無法通過胚胎干細(xì)胞(ES)途徑實現(xiàn)基因打靶的脊椎動物,TALEN為其提供了有力的、不依賴于ES細(xì)胞的反向遺傳學(xué)工具,為以斑馬魚為模式的基因功能研究帶來了革命性的改變。但是,在不少物種中,TALEN的應(yīng)用仍然局限于基于NHEJ的定點隨機(jī)突變和篩選上;通過HR精確改變基因組的特定序列仍然存在一些難度。例如,對于斑馬魚而言,利用TALEN技術(shù)實現(xiàn)基于同源重組的基因組精確修飾,將使斑馬魚的反向遺傳學(xué)技術(shù)得到進(jìn)一步完善。最近,有報道短的單鏈DNA(ssDNA)可以精確地插入/置換斑馬魚的基因組。不過,該策略存在一定局限性和不確定性。例如,這一策略每次只能插入一個loxP序列,如果要實現(xiàn)條件性基因突變(靶基因兩側(cè)需要分別插入一個loxP序列),就必須連續(xù)進(jìn)行兩輪TALEN打靶,實驗周期較長;目前還無法確定能否利用這一策略插入較大的外源序列(例如GFP報告基因);此外,短片段的供體序列有可能容易隨機(jī)插入斑馬魚基因組,而在整個斑馬魚基因組中尋找/鑒定隨機(jī)插入的僅為80bp左右的短片段供體序列在技術(shù)上顯然存在不小的難度。這無疑會給后續(xù)研究帶來麻煩和潛在的脫靶風(fēng)險,這一問題仍有待實驗評估。最近,本實驗室采用含有GFP報告基因、傳統(tǒng)的長雙鏈DNA作為供體,在TALEN的介導(dǎo)下在斑馬魚中成功實現(xiàn)了同源重組基因打靶(相關(guān)的論文已被NatureMethods接受)。這一策略在理論上應(yīng)該能夠避免上述短片段供體DNA所帶來的一系列問題,不僅能夠插入較長的外源序列,而且還有可能縮短實驗周期,同時很容易鑒定并區(qū)分供體序列在基因組中的隨機(jī)插入與精確整合。隨著TALEN技術(shù)的廣泛應(yīng)用和不斷發(fā)展,斑馬魚在模式動物遺傳發(fā)育基礎(chǔ)理論研究以及疾病模型構(gòu)建和藥物篩選等應(yīng)用研究中的地位無疑會顯得越來越重要。雖然人們對TALE與靶序列識別與結(jié)合的規(guī)律已經(jīng)有了較多的了解,其核心秘密——RVD與靶點的一一對應(yīng)性——也格外地簡單明了。但是在實際應(yīng)用中,并非所有的TALEN都能夠成功地引起靶基因產(chǎn)生突變。目前,本實驗室已成功構(gòu)建了100多對針對斑馬魚不同基因組位點的TALEN,經(jīng)內(nèi)切酶檢測,突變成功率大于70%(未發(fā)表數(shù)據(jù)),這與Cade等人最近報道的結(jié)果類似。本