產苯乳酸乳酸菌的篩選與鑒定

隨著人們生活水平的提高和健康意識的提高，人們對食品的質量有了更高的要求。除了食品的營養、感覺和包裝外，食品的安全性也值得關注。由于食品的特殊性,其防腐保鮮一直是研究的重要方面。長期以來,由于受到經濟環境和開發水平的制約,幾乎所有的食品都采用化學合成防腐劑來延長食品的保質期。化學防腐劑如果超劑量使用會產生累積毒性和致癌作用,存在局限性。因此,具有安全、廣譜、高效及經濟實用的天然食品防腐劑的開發和生產成為食品防腐領域發展的趨勢和要求。苯乳酸(phenyllacticacid,PLA),也稱3-苯基乳酸,是近年來發現的一種新型天然防腐劑,具有良好的抑菌性,能夠抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌,且安全性能高、水溶性好、熱穩定,在食品工業中具有較好的應用前景。苯乳酸可由多種微生物產生,如霉菌中的白地霉,細菌中的丙酸菌和乳酸菌,其中乳酸菌因其悠久的應用歷史和廣泛的應用范圍在食品工業中占有特殊的地位,因此乳酸菌來源的苯乳酸成為研究熱點。筆者采用雙層平板法從傳統發酵制品中分離,篩選出1株產苯乳酸的乳酸菌,并進行了鑒定,以期為進一步育種研究奠定基礎。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1采樣發酵制品購自錦州大潤發超市。1.1.2指的是細菌啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。1.1.3ph值調ph改良TJA培養基:酵母粉5g/L,牛肉膏10g/L,乳糖20g/L,葡萄糖2g/L,磷酸氫二鉀2g/L,乙酸鈉5g/L,吐溫-801ml,番茄汁50ml。調pH值至6.2～6.4。初篩培養基:改良TJA培養基中添加質量分數為2.5%CaCO3,0.5%的山梨酸鉀(抑制真菌生長),1.5%的瓊脂。液體發酵培養基:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,牛肉膏10g/L,葡萄糖20g/L,K2HPO32g/L,NaCO30.4g/L,MgSO40.5g/L,FeSO40.01g/L。調pH值至6.2～6.4。指示菌培養基:麥芽浸膏20g/L,蛋白胨1g/L,葡萄糖20g/L,瓊脂粉15g/L。調pH值至5.4。1.1.4主要試劑苯乳酸購自ALFA公司,其他材料為市售。其中,甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。1.1.5主要設備和設備日立高效液相色譜系統:配有日立L-7420紫外檢測器和Kromasil-C18反向色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)。1.2方法1.2.1過濾方法(1)單菌落的篩選在無菌操作臺將發酵制品搗碎倒入三角瓶中加20ml無菌水充分振蕩,取10ml接種于初篩培養基中30℃培養24h,采用常規平板稀釋法,挑選有碳酸鈣溶解圈的單菌落并鏡鑒。將革蘭氏陽性,接觸酶陰性的菌體接種到斜面培養基上30℃培養24h,放入冰箱保存。(2)培養基制備采用雙層平板拮抗法篩選,下層培養基為固體改良TJA,受試菌再下層培養基劃線,長度為2cm左右,置于生化培養箱中30℃培養48h后傾注10ml上層指示菌培養基,將指示菌配成濃度為106CFU/ml菌懸液于上層培養基涂布。30℃培養48h,觀察抑菌情況。1.2.2乙醇萃取制備工藝將經過篩選獲得的菌株接種液體發酵培養基,30℃培養48h。取10ml發酵液,加20ml乙醇,5000r/min離心15min,取上清液,95℃水浴40min,分別用10ml乙醚萃取2次,合并2次萃取液,50℃揮干,用甲醇溶解定容至10ml,冰箱冷藏備用。1.2.3n的變化情況HPLC條件:流動相為甲醇和水的混合液,梯度洗脫程序:0～15min由70%甲醇線性變化至100%,15～20min保持100%甲醇,20～22min由100%甲醇線性變化至70%。檢測波長:210nm,流速為1ml/min,柱溫為30℃,進樣量為10μl。1.3識別菌株1.3.1觀察蘑菇的形態將獲得的高產菌株接種于改良TJA固體培養基上,30℃培養48h,觀察菌落形態,并進行革蘭氏顏色,莢膜染色,于光學顯微鏡下觀察。1.3.2對蘑菇的生理生化評價按照《伯杰細菌鑒定手冊》進行菌株的生理生化特性鑒定。1.3.3srd核酸序列分析(1)16SrDNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成,將測定的16SrDNA序列在NCBI核酸數據庫進行BLAST搜索,與數據庫中已有的16SrDNA序列進行相似性比較分析。(2)從GenBank中選擇近緣菌株的16SrDNA基因序列,應用MEGA4.1軟件進行ClustalW多重比對,采用Neighbour-joining方法構建系統發育樹,并進行bootstrap分析,重復次數為1000次。2結果與分析2.1發酵培養中苯乳酸含量檢測以啤酒酵母為指示菌,經過雙層培養基法從初篩得到的115株乳酸菌分離株中篩選出24株對啤酒酵母有明顯抑制效果的菌株,結果見表1。將菌株接種于液體發酵培養基發酵,30℃靜置培養48h后檢測發酵液中苯乳酸含量。結果發現24株菌均產苯乳酸,其中有7株菌的苯乳酸產量>60mg/L。乳酸菌菌株P421顯示出最高的苯乳酸生產能力,在液體發酵培養基中30℃培養48h,苯乳酸產量可達80.5mg/L,菌株P421的發酵液HPLC圖譜見圖1,其對啤酒酵母的拮抗作用見圖2。2.2高產菌株的識別2.2.1織物的變化,菌株P421在改良TJA培養基上生長菌落光滑,濕潤,乳白色;顯微鏡觀察表明,菌體形態為桿狀,單獨、成對或短鏈排列,革蘭氏染色呈陽性,無莢膜,無芽孢,不形成孢子。2.2.2植物乳桿菌的鑒定根據常規生理生化鑒定,結果見表2,參照《伯杰細菌鑒定手冊》,初步判定P421為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。2.2.3srdna分析測序結果表明該菌株的16SrDNA序列共1527bp,將序列提交GenBank數據庫,得到登錄號為GQ360031,在GenBank數據庫中與已有的16SrDNA序列進行相似性比較分析,從中選擇近緣菌株的16SrDNA基因序列,應用MEGA4.1軟件構建系統進化樹。由圖3可知,P421與L.plantarumWCFS1和L.plantarumEW-p位于同一簇群,1000次bootstrap分析完全支持該分枝,同源性達100%,與乳酸菌的其他種的發育關系相對較遠。根據P421的形態特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,將菌株P421鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),并命名為LactobacillusplantarumP421。L.plantarumP421在系統發育地位上屬于Bacteria、Firmicutes、Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillaceae