京尼平苷及其腸道代謝物京尼平在大鼠體內的藥代動力學研究

梔子是紫草科的一棵干燥、成熟的果實。經衛生部批準可用于醫藥和膳食。藥用時,梔子常用作保肝利膽中藥;在保健品中,常用于化學性肝損傷的輔助治療。京尼平苷為梔子中的主要活性成分,且含量較高,大鼠灌胃給予280mg·kg-1的京尼平苷能導致嚴重的肝損傷。本實驗觀察了京尼平苷及其代謝物京尼平的藥代動力學,為其安全、合理用藥提供依據。1材料表面1.1藥品理劑所需京尼平苷購自安徽亳州亞強天然產物制品廠,經HPLC峰面積歸一法測定京尼平苷含量為98.5%;京尼平苷和芍藥苷均購自中國藥品生物制品檢定所(批號分別為110749-200511,110736-200526);京尼平,經HPLC峰面積歸一法測定京尼平含量不少于96.0%,β-葡萄糖苷酶(Fluka,productofSigma-Aldrich,Lot&Fillingcode:1076858,11505106)。1.2萃取小柱aglent地社會網Waters系列高效液相色譜儀系統,包括1515等度泵,2487型雙波長紫外檢測器,717自動進樣系統,色譜數據軟件Empower2software(USA);AccuBOND-C18固相萃取小柱100mg·mL-1(AgilentTechnologiesInc,USA);VenusilMP-C18色譜柱[4.6mm×150mm,5μm(AgelaTechnologiesInc,USA)];生物利用度研究數據處理通用程序BAPP2.0,中國藥科大學藥代中心開發。1.3動物SD大鼠,雄性,體重260～300g,由北京維通利華實驗動物有限公司提供,動物合格證號:SCXK(京2002-0003)。2方法2.1苷酶的分離純化參照文獻方法制備,取1.0g京尼平苷和40mgβ-葡萄糖苷酶溶于20mL水中,在37℃的水浴中水解4h后取出,以乙醚萃取,合并乙醚液,無水硫酸鈉脫水后,揮干乙醚,經乙醚重結晶后,在2.2條件下,按峰面積歸一法計算,純度為96.9%。2.2條件1流動相:甲醇-水-冰醋酸(35∶65∶0.2);柱溫30℃;檢測波長238nm;流速0.9mL·min-1,進樣量5μL。2.3方法研究2.3.1對照品溶液的制備精密稱取對照品京尼平苷、京尼平各1.87,2.97mg加甲醇溶解,稀釋定容至50mL,分別制成37.4,59.4μg·mL-1的對照品溶液;精密稱取內標物芍藥苷2.16mg以高純水溶解,稀釋定容至25mL,即得86.4μg·mL-1的芍藥苷內標溶液,備用。2.3.2線性回歸的線性方程取一系列濃度的京尼平和京尼平苷對照品溶液用N2去掉溶劑加入空白血漿500μL,按2.5操作處理,計算相應對照品和內標物峰面積比值(Y),對應對照品的濃度X,經線性回歸的直線方程如下:京尼平苷,Y=12883.57X-666.87(r=0.999);京尼平,Y=11955.07X-411.11(r=0.996);即京尼平苷濃度在93.5～1.87μg·mL-1線性關系良好;京尼平濃度在5.94～29.70ng·mL-1線性關系良好。京尼平苷和京尼平的檢測限分別為7.6,5.5ng·mL-1。2.3.3返回率實驗2.3.3.含藥血漿的制備μg·mL-1的京尼平苷溶液300μL,N2吹干,精密加入空白血漿1.2mL混勻(9.35μg·mL-1),分別吸取含藥血漿500,400,100μL,再加入空白血漿0,100,400μL,按照2.5操作處理。同樣,取上述37.4μg·mL-1濃度的京尼平苷溶液加入甲醇按同樣比例稀釋,進樣分析,京尼平苷高、中、低3個濃度平均加樣回收率78.4%。2.3.3.加樣回收率試驗μg·mL-1的京尼平溶液100μL,N2吹干,精密加入空白血漿1.0mL混勻(5.94μg·mL-1),分別吸取含藥血漿500,100μL,再加入空白血漿0,400μL,按照2.5操作處理,同樣,取上述59.4μg·mL-1的京尼平溶液加入甲醇按同樣比例稀釋,進樣,HPLC分析,京尼平高、低2個濃度的平均加樣回收率98.6%。2.3.4空液壓測定同一樣品連續測定總法取上述同一樣品連續重復進樣5次測定,計算日內RSD=1.6%(京尼平苷)、2.3%(京尼平),第2～5天,取上述同一樣品連續測定5次,計算日間RSD=2.9%(京尼平苷)、3.5%(京尼平)。2.4血漿藥物濃度檢測取雄性SD大鼠10只,隨機分成2組,每組5只,實驗前禁食14h,灌胃給予280mg·kg-1的京尼平苷溶液,第1組分別于給藥后0.17,0.5,1.0,2.5,12.5h,第2組分別于給藥后0.33,0.75,1.5,5.0,8.0h,眼眶取血1.5mL于肝素化的試管中,照2.5操作,記錄各樣品圖譜,按內標法峰面積定量計算血漿藥物濃度。2.5spe無固液分離經眼眶取血1.5mL于肝素化的試管中,輕輕混勻,10000r·min-1離心15min,分離血漿500μL,上樣于已預處理好的SPE小柱,加入內標物溶液50μL;先用水1mL沖洗,再以甲醇500μL洗脫,收集甲醇洗脫液,0.2μm濾膜過濾,HPLC分析,內標法計算各自血漿藥物濃度。3結果3.1減少京尼平苷、內標物、京尼平各峰的電導率測定經過預處理樣品色譜圖中內源性干擾成分大為減少,京尼平苷、內標物、京尼平各峰均達到基線分離,保留時間分別為6.39,7.93,10.70min,可見該方法專屬性強。3.2藥代動力學參數不同時間點的血藥濃度,經BAPP統計擬合后,以AIC和R判斷房室模型和選擇參數,京尼平苷和京尼平均符合一室模型,在體內的平均滯留時間分別為2.4,7.9h,無明顯蓄積現象,藥代動力學參數見表1。4京尼平苷及其后血漿中梔子藍的檢測血藥濃度經時數據經BAPP統計擬合后,京尼平苷和京尼平均符合一室模型。京尼平苷在血漿中代謝消除,單次給藥經12.5h后京尼平苷血漿濃度僅為Cmax的2%,且消除速率常數為(0.75±0.24)h-1;京尼平達峰血藥濃度很低,Cmax僅為(17.41±5.27)ng·mL-1。有文獻報道京尼平苷引起的肝毒性與其在腸道轉化成京尼平有關,但本研究發現京尼平血藥濃度很低,且京尼平可以與甘氨酸結合而生成較強生物活性的梔子藍,據此推測,梔子藍可能為其導致肝毒性的直接物質基礎。京尼平苷及代謝物組織分布與毒性的相關性研究尚在研究。本實驗首次建立了內標法同時測定生物樣品中京尼平苷及京尼平含量測定方法,選用性質較為近似的芍藥苷作為內標物可以較好的消除樣品處理過程中產生的誤差,同時還可以克服生物樣品回收率低的問題;文獻采用外標法同時測定血漿中的京尼平苷及其京尼平,但是采