第七章：培養細胞中克隆基因的表達及動物基因工程本章概述基因調控的研究（有關原核和真核生物的表達載體、報告基因等）基因在細胞系中表達的方法篩選陽性轉基因動物細胞的遺傳標記哺乳動物中瞬時轉化載體（以SV40為例）基因定點敲除技術第一節基因調控的研究一、表達載體一類在多克隆位點的5‘端含有轉錄啟動子的克隆載體。由于真核生物和原核生物啟動子的不同，需要針對不同的宿主設計不同的載體。A、在大腸桿菌中的外源基因表達載體(1)典型的原核基因以及其RNA的特點轉錄終止序列

GC-richinvertedrepeat5’-GTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACT

CAGTTTTCGGAGGCCAGCCTCCGAAAACTGA-5’RunofAresidues依賴ρ因子的終止子不依賴ρ因子的終止子真核基因的啟動子不能被原核RNA聚合酶識別真核基因在原核生物中表達，必須把基因序列置于原核基因的框架內.(2)真核基因和原核基因的區別(3)啟動子是表達載體的關鍵部分——選擇啟動子

······TTGACA

·····························TATAAT

····GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTACGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGACACTTGATACTGTATGAAGCATACAGTATAATTGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTTAATGT

-35Region-10GegionConsensuslactrpλPLrecAtacItacII-10和-35堿基序列和通序啟動子的強弱與它們與共有序列的相似程度有關。相似性越高，就越強；反之。。。。。序列盒和基因融合在載體上將啟動子、核糖體結合位點和終止信號按較合理的置于載體上，這樣的序列叫做序列盒外源基因插入在序列盒中間，通常與細菌的一段基因形成融合基因，所以在構建這類載體時，一定需要閱讀框的正確。融合載體的四大優點：利用大腸桿菌天然序列，可以保證有效地翻譯起始防止外源蛋白被降解可以被輸出到胞外，利于純化可以便于親和層析(4)大腸桿菌中高效表達基因的策略優化表達載體的設計提高稀有密碼子tRNA的表達作用提高外源基因mRNA的穩定性提高外源基因表達產物的穩定性優化發酵過程B、在真核細胞中外源基因表達載體真核生物的啟動子序列包含：1）核心元件（TATA盒，起始子等）2）上游元件(CAAT盒等）3）遠上游調控(增強子等）B、真核生物的表達載體通常含有真核基因的啟動子序列表達載體的啟動子區基本表達組成型表達細胞特異表達調節型表達MCSTATASP1AP1CAAT細胞特異調節型表達二、報告基因報告基因應滿足的條件1）編碼特異的蛋白酶活性，宿主細胞中沒有2）酶活檢測應快速、簡便、靈敏等3）報告蛋白不影響宿主細胞的正常活性常用的GFP(YFP)、lacZ、GUS等第二節基因在細胞中的表達方法一、基因轉染的策略

一般基因轉化的的策略直接轉化:用物理的方法直接將外源DNA轉進細胞中去。

轉染:用一系列物理和化學的方法迫使細胞能從周圍的介質中接受DNA。?轉導:動物病毒animalvirus一、基因轉染的策略1.DNA/磷酸鈣共沉淀的方法轉化過程A、將待轉染的DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液B、逐滴加入到Hepes-磷酸鹽緩沖液中，形成磷酸鈣-DNA共沉淀C、用吸管將共沉淀物加到培養的哺乳動物單層細胞表面，會迅速被細胞捕獲，頻率約10％（二）脂質體介導的轉染脂質體(liposomes)是一種人造的脂質小泡，外周是脂雙層，內部是水腔一、基因轉染的策略一、基因轉染的策略（三）電穿孔法在高壓電脈沖的作用下使細胞膜上出現微小的孔洞，從而促使不同細胞之間發生原生質體融合或促使細胞吸收外界環境中的DNA分子一、基因轉染的策略（四）、直接轉化－微注射真正的顯微注射穿刺一、基因轉染的策略二、瞬時轉染（轉化）外源DNA不與宿主的基因組DNA整合，轉化細胞在較短的時間內進行轉錄和翻譯。常用于較短時間的實驗，如啟動子功能檢測，蛋白質亞細胞定位等三、穩定轉化外源基因整合到細胞染色體中，隨著細胞的分裂而傳代（或子代的形成），產生穩定的轉基因細胞系（或個體）。通常用于研究基因的功能或改變生物個體的性狀。第三節：篩選陽性轉基因動物細胞的遺傳標記內源的選擇標記這些基因存在于野生型的細胞中只能在相關基因發生了突變（失去功能）的突變體細胞中應用顯性的選擇標記賦予細胞一個完全新的表型，可以在多個細胞系中進行利用。哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記

遺傳標記編碼產物篩選藥物作用機理APH-氨基糖苷磷酸轉移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋呤DHFR突變體抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉移酶 潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A1.胸苷激酶基因選擇系統TK－細胞

把細胞培養在加有胸苷類似物5-溴尿嘧啶脫氧核苷（BUdR）的培養基中，在胸苷激酶（TK）的催化下，BUdR便摻入到細胞的DNA分子上，致使DNA復制出現錯誤。具有BUdR-DNA的細胞對UV特別敏感，被迅速地殺死，而少數TK－的細胞便能存活下來HAT選擇法：在含有次黃嘌呤(Hypoxanthine)、氨基蝶呤(Aminopterin抑制了正常的核苷酸合成)和胸苷(Thymidine)的培養基中篩選TK+細胞共轉化選擇。在磷酸鈣沉淀中，有兩種形體上沒有連接的DNA組成的混合物，能夠同時轉化受體細胞將無選擇標記的DNA與具TK選擇標記基因的DNA進行混合轉化外源DNA可整合到核基因組的任何部位把TK基因先與非選擇標記基因連接起來，也能共轉化1.胸苷激酶基因選擇系統90%的TK+細