PAGE以疾病為主線的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)編者：陳慧梅蔣愛芹凌立君南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院二○一四年五月

目錄第一章細(xì)胞分子生物學(xué)常用儀器設(shè)備及操作 31.常用儀器設(shè)備…………...32.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及設(shè)備……………………...43.常用操作………………..10第二章細(xì)胞與分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù) …………..131.分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)………….132.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)………….13第三章細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) 14實(shí)驗(yàn)一考馬斯亮藍(lán)染色法顯示細(xì)胞骨架………...14實(shí)驗(yàn)二臺(tái)盼藍(lán)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)……………….16實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)………..17實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)……………………..19實(shí)驗(yàn)五PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)………………….21實(shí)驗(yàn)六肝細(xì)胞的原代分離及培養(yǎng)………………….23實(shí)驗(yàn)七M(jìn)TT法檢測細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)…………………25實(shí)驗(yàn)八涂片染色法觀察骨髓自然凋亡細(xì)胞 ……..27實(shí)驗(yàn)九人類外周血染色體標(biāo)本的制備……………29實(shí)驗(yàn)十G顯帶染色體標(biāo)本制備與識(shí)別……………31第四章生化分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) …33實(shí)驗(yàn)一血清肌酸激酶活性測定……………………..33實(shí)驗(yàn)二血清銅藍(lán)蛋白測定實(shí)驗(yàn)……………………..35實(shí)驗(yàn)三外周血細(xì)胞基因組DNA的提取(NaI法)………………37實(shí)驗(yàn)四堿裂解法提取質(zhì)粒DNA…………39實(shí)驗(yàn)五聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增）……………….42實(shí)驗(yàn)六限制性內(nèi)切酶消化實(shí)驗(yàn)…………………….'44實(shí)驗(yàn)七瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)……….’45實(shí)驗(yàn)八大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化………………47第五章臨床群體遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)…………………..50實(shí)驗(yàn)一PTC嘗味實(shí)驗(yàn)…………………50實(shí)驗(yàn)二遺傳咨詢……………………….51

第一章細(xì)胞分子生物學(xué)常用儀器設(shè)備及操作1.常用儀器設(shè)備1.1測量設(shè)備固體的測量設(shè)備：各種量程、精度的電子天平等，用以稱取一定質(zhì)量的固體藥品液體的測量設(shè)備：量筒、移液管、微量移液器等，用于量取一定體積的液體試劑。pH值的測量設(shè)備：pH試紙，pH計(jì)，直接測量溶液的pH值。光密度值的測量設(shè)備：分光光度計(jì)，通過OD值反映核酸、菌液等的濃度。1.2滅菌消毒及凈化設(shè)備高壓蒸汽滅菌器：常用于玻璃器皿、培養(yǎng)基、試劑等在使用前的滅菌和一些有潛在危險(xiǎn)的細(xì)菌、病毒等在丟棄前的滅菌。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121干熱滅菌烘箱：用于金屬器械、瓷器和玻璃器皿（如剪刀、鑷子、三角瓶和培養(yǎng)皿等）的干熱滅菌，溫度可達(dá)160℃除菌過濾器：用于不耐高溫、高壓的試劑滅菌（如抗生素、維生素或血清等）。常用濾膜孔徑為0.22μm（能去除樣品、流動(dòng)相中極細(xì)顆粒的要求，可以達(dá)到GMP或者藥典規(guī)定的除菌99.99%的要求）或0.45μm（能濾除大多數(shù)細(xì)菌微生物，降低細(xì)菌負(fù)荷；常規(guī)樣品、流動(dòng)相過濾，能夠滿足一般色譜要求）。紫外燈：用于無菌室和超凈臺(tái)等空氣滅菌。超凈工作臺(tái)：原理是由鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣，經(jīng)過低、中效的過濾器后，通過工作臺(tái)面，使實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域成為無菌的環(huán)境。1.3溫控及干燥設(shè)備冰箱及冷柜：用于試劑、酶、抗生素和菌種等的保藏。4℃合適貯存某些溶液、試劑、藥品等。-20℃適用于某些試劑、藥品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白質(zhì)樣品等。-80℃液氮罐：用于長期儲(chǔ)存細(xì)胞、病毒或某些微生物，或?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供液氮。培育箱：37℃恒溫培育搖床：用于大腸桿菌等生物工程菌種的擴(kuò)增。水浴鍋：用于保溫并進(jìn)行各類試驗(yàn)。25-100℃水浴搖床可用于分子雜交試驗(yàn)，各種生物化學(xué)酶反響等試驗(yàn)的保溫。含低溫的水浴槽能夠用于分子生物學(xué)的質(zhì)粒與基因片段的銜接等試驗(yàn)及用于42烘箱：主用于烘干試驗(yàn)器皿，有些需求溫度高些，有些需求溫度低些。用于RNA方面的試驗(yàn)用具，需求在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-451.4電泳及檢測設(shè)備電泳體系：電泳技能是檢測、判定各種生物大分子的純度、含量及描繪它們的特征，乃至仍是別離、純化、收回和濃縮樣品的東西之一。電泳體系分為電源和電泳槽，電源需經(jīng)穩(wěn)流經(jīng)過穩(wěn)壓器，既能供給安穩(wěn)的直流電，又能輸出安穩(wěn)的電壓；水平式電泳槽：通常分為微型電泳槽和大號(hào)水平式電泳槽，通常用于核酸的電泳；垂直電泳槽通常用于蛋白質(zhì)的電泳。凝膠成像系統(tǒng)：用于電泳后含溴化乙錠的核酸樣品的觀察分析。1.5顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡：正置型及倒置型生物顯微鏡根據(jù)不同的應(yīng)用需求。熒光顯微鏡：熒光就是某些物質(zhì)在一定波長光(如紫外光)的照射下，在極短時(shí)間內(nèi)所發(fā)出的比照射光波長更長的可見光。熒光顯微鏡結(jié)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀測的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。相差顯微鏡：相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位,并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象,把相差變成振幅差(明暗差)，同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差，可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。1.6其它設(shè)備超純水機(jī)：用自來水、蒸餾水、離子交換水、反滲透純水做為供水，磁鐵耦合齒輪泵效果使水循環(huán)。用于PCR、PCR氨基酸剖析、DNA測序、酶反響、安排和細(xì)胞培育等。高速離心機(jī)：根據(jù)各種物質(zhì)在質(zhì)量、沉降系統(tǒng)等方面的差異，利用強(qiáng)大的離心力場，用于細(xì)胞和生物大分子等的分離、純化和濃縮。按轉(zhuǎn)速的不同，可分為普通離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)等，有冷凍和常溫兩種。PCR儀：PolymeraseChainReaction儀，也稱DNA熱循環(huán)儀，基因擴(kuò)增儀，它是使一對(duì)寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)DNA鏈上的靶序列兩邊，然后酶促組成拷貝數(shù)百萬倍的靶序列DNA基因片段，它的每一循環(huán)包含在三種不一樣溫度進(jìn)行的DNA變性，引物復(fù)性，DNA聚合酶催化的延伸反響三個(gè)進(jìn)程。需求闡明的是，有些試驗(yàn)室能夠還需求梯度PCR儀或?qū)嵤露繜晒釶CR儀來進(jìn)行一些特別的分子生物學(xué)試驗(yàn)。1.7其他微波爐：便于一些溶液的疾速加熱和定溫加熱，電泳瓊脂糖凝膠制作、溶化等。制冰機(jī)：用于制作大多數(shù)核酸、蛋白質(zhì)的試驗(yàn)操作所需的低溫環(huán)境，以削減核酸酶或蛋白質(zhì)酶的水解。磁力攪拌器：多角度旋轉(zhuǎn)混勻器、疾速振動(dòng)混合器：用于混合儀器。勻漿器：超聲安排及細(xì)胞破碎器，用其進(jìn)行樣品的別離提純?cè)囼?yàn)。通風(fēng)櫥：許多溶劑能逸出毒氣，必備柜，放射性試驗(yàn)還要有有機(jī)玻璃屏蔽。Tip頭、Eppendorf管：微管移液器tip頭（吸液尖）、Eppendorf管（微量離心管）可洗刷，硅化消毒后重復(fù)運(yùn)用。對(duì)一些需求嚴(yán)厲的試驗(yàn)，如RNA的獲取、保管等操作，應(yīng)運(yùn)用新的消毒tip頭與Eppendorf管。別的還應(yīng)備有常用標(biāo)準(zhǔn)的離心管（1000ml、500ml、250ml、50ml、7ml等）及96孔、24孔、12孔、6孔的細(xì)胞培育塑料平板等。小型設(shè)備、用具：定時(shí)器、濾膜、保鮮膜、防護(hù)眼鏡鴨嘴鑷、慣例的玻璃或塑料器皿（包含平皿、試管、燒杯、量瓶、試劑分液漏斗、避光保管的試劑應(yīng)運(yùn)用棕色試劑瓶，如飽滿酚、巰基乙醇等、記號(hào)筆、各種手套PE、乳膠、家用、防酸的等）

2.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及設(shè)備2.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chǔ)藏。無菌操作區(qū)：無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，最好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分：a)更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。b)緩沖間—―位于更衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。c)無菌操作間—―專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高（不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑無死角以便清潔和消毒。無菌操作間的空氣消毒：紫外線燈—－產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。空氣過濾的恒溫恒濕裝置—－最好。凈化工作臺(tái)：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺(tái)主要有兩種：a)側(cè)流式或稱垂直式b)外流式或稱水平層流式。凈化工作臺(tái)工作原理（大致相同）—－通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。側(cè)流式工作臺(tái)—－空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過工作臺(tái)面流向?qū)?cè)，也有從上向下或從下向上流向?qū)?cè)，形成氣流屏障保持工作區(qū)無菌。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為封閉式。外流式（水平式）工作臺(tái)—凈化后的空氣面向操作者流動(dòng)，因而外方氣流不致混入操作，但進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作則對(duì)操作者不利。孵育區(qū)：本區(qū)對(duì)無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行。制備區(qū)：在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。儲(chǔ)藏區(qū)：主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無塵。清洗和消毒滅菌區(qū)：清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作。2.2細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備2.2.1常用的基本設(shè)備顯微鏡：倒置顯微鏡——是組織細(xì)胞培養(yǎng)室所必需的日常工作常規(guī)使用設(shè)備之一，便于掌握細(xì)胞的生長情況并觀察有無污染等。若有條件，尚可配置帶有照相系統(tǒng)的高質(zhì)量相差顯微鏡、解剖顯微鏡、熒光顯微鏡、錄像系統(tǒng)或縮時(shí)電影拍攝裝置等，以便隨時(shí)觀察、記錄、攝影細(xì)胞生長情況。CO2培養(yǎng)箱：能夠提供進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所需要的一定量的CO2（常用濃度為5％），易于使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用于開放或半開放培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的器皿可用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶；當(dāng)使用培養(yǎng)瓶時(shí)，可將瓶蓋略微旋松，使培養(yǎng)瓶內(nèi)與外界保持通氣狀態(tài)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿內(nèi)部與外界相通，培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保持清潔，應(yīng)定期以紫外線照射或酒精消毒。同時(shí)培養(yǎng)箱應(yīng)放置盛有無菌蒸餾水的水槽，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)，使箱內(nèi)相對(duì)濕度始終保持為100％。干燥箱：用于細(xì)胞培養(yǎng)箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等須干熱消毒。干熱消毒時(shí)，電熱干燥箱升溫較高，一般需達(dá)到160℃以上。通常使用鼓風(fēng)式電熱干燥箱。其優(yōu)點(diǎn)是溫度均勻、效果較好，缺點(diǎn)是升溫過程較慢。升溫時(shí)不能先升溫后鼓風(fēng)而應(yīng)鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開始，至100℃時(shí)，停止鼓風(fēng)，應(yīng)避免包裹器皿的紙或棉花燒焦，燒焦的碎屑可影響細(xì)胞的生長。消毒后，不能立即打開箱門以免驟冷而導(dǎo)致玻璃器皿損壞，應(yīng)等候溫度自然下降至100℃以下方可開門。水純化裝置：細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高，細(xì)胞培養(yǎng)以及與細(xì)胞培養(yǎng)工作相關(guān)的液體的配制用水必須事先嚴(yán)格純化處理。水純化時(shí)可采用離子交換裝置或蒸餾器。離子交換純水尚不能有效去除有機(jī)物，因此用水時(shí)尚需再次蒸餾。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用三次蒸餾水，即使是用于玻璃器皿的沖洗，也應(yīng)使用二次以上蒸餾水。冰箱：細(xì)胞培養(yǎng)室必須配備。a）普通冰箱或冷藏柜：儲(chǔ)存培養(yǎng)液、生理鹽水、Hank’s液試劑等培養(yǎng)用的物品及短期保存組織標(biāo)本。b）低溫冰箱（-20℃）、超低溫冰箱：儲(chǔ)存需要冷凍保存生物活性及較長時(shí)期存放的制劑，如酶、血清等。細(xì)胞培養(yǎng)室的冰箱應(yīng)屬專用，不得存放易揮發(fā)、易燃燒等對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)，且應(yīng)保持清潔。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器：儲(chǔ)存器常用的是液氮容器。根據(jù)使用需要分為不同的類型及多種規(guī)格。選擇購置液氮容器時(shí)要綜合考慮容積大小，取放使用方便及液氮揮發(fā)量（經(jīng)濟(jì)）三種因素。液氮容器的大小可自25L～500L，可以儲(chǔ)存1ml的安瓿250～15000個(gè)左右。液氮溫度可低達(dá)-196℃，使用時(shí)應(yīng)防止凍傷。由于液氮不斷揮發(fā)，應(yīng)注意觀察存留液氮情況，及時(shí)定期補(bǔ)充液氮，避免揮發(fā)過多而致細(xì)胞受損。離心機(jī)：進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，常規(guī)需要進(jìn)行制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度、洗滌、收集細(xì)胞等工作，通常需要使用離心機(jī)。a）一般可常規(guī)配置4000rpm的國產(chǎn)臺(tái)式離心機(jī)，例如細(xì)胞沉降，使用80～100g的離心機(jī)即可，離心力過大有時(shí)可能引起細(xì)胞的損傷。b)另外，可根據(jù)需要添置其他類型如大容量或可調(diào)節(jié)溫度的離心機(jī)等。c）若需特殊用途，例如某些細(xì)胞的分離制備需梯度離心，另行配置實(shí)驗(yàn)所需的具備其他特殊功能的離心機(jī)。其它設(shè)備：a)消毒器：直接或間接與細(xì)胞接觸的物品均需消毒滅菌處理。b）濾器：目前細(xì)胞培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細(xì)菌。2.2.2培養(yǎng)器皿：供細(xì)胞接種、生長等用的器皿，可由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃或無毒而透明光滑的特制塑料制成。a）玻璃培養(yǎng)器皿的優(yōu)點(diǎn)是多數(shù)細(xì)胞均可生長，易于清洗、消毒，可反復(fù)使用，并且透明而便于觀察；缺點(diǎn)是易碎，清洗時(shí)費(fèi)人力。b）塑料制培養(yǎng)器皿的優(yōu)點(diǎn)是一次性使用，廠家已消毒滅菌密封包裝，打開即可用于細(xì)胞培養(yǎng)操作。常用的培養(yǎng)器皿：a)培養(yǎng)瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培養(yǎng)、繁殖細(xì)胞。進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)瓶瓶口加蓋螺旋瓶蓋或膠塞，膠塞多用于密封培養(yǎng)。國產(chǎn)培養(yǎng)瓶的規(guī)格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；進(jìn)口培養(yǎng)瓶則多以底面積（cm2）表示。b)培養(yǎng)皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分離、處理組織或做細(xì)胞毒性、集落形成、單細(xì)胞分離、同位素?fù)饺搿⒓?xì)胞繁殖等實(shí)驗(yàn)使用。常用的培養(yǎng)皿規(guī)格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。c)多孔培養(yǎng)板：為塑料制品。可供細(xì)胞克隆及細(xì)胞毒性等各種檢測實(shí)驗(yàn)使用。其優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約樣本及試劑，可同時(shí)測試大量樣本，易于進(jìn)行無菌操作。培養(yǎng)板分為各種規(guī)格，常用的規(guī)格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。各種單層生長的細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中長滿時(shí)可獲得的細(xì)胞數(shù)，主要是取決于器皿的底表面積和細(xì)胞體積的大小。常用培養(yǎng)器皿及可獲得的細(xì)胞數(shù)（以Hela細(xì)胞為例）見表2。表2常用的培養(yǎng)器皿及可獲得的細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)器皿底面（cm2）加培養(yǎng)液量（ml）可獲細(xì)胞量96孔培養(yǎng)板0.320.11×10524孔培養(yǎng)板21.05×10512孔培養(yǎng)板4.52.01×1066孔培養(yǎng)板×1064孔培養(yǎng)板285.07×1063.5cm培養(yǎng)皿83.02.0×1066cm培養(yǎng)皿215.05.2×1069cm培養(yǎng)皿4910.012.2×10610cm培養(yǎng)皿5510.013.7×10625cm塑料培養(yǎng)瓶255.05×10675cm塑料培養(yǎng)瓶7515~302×10725ml玻璃培養(yǎng)瓶194.03×106100ml玻璃培養(yǎng)瓶37.510.06×106250ml玻璃培養(yǎng)瓶7815.07×1072500ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶700100~2502.0×108培養(yǎng)操作有關(guān)的器皿：a)貯液瓶：主要用于存放或配制各種培養(yǎng)用液體如培養(yǎng)液、血清及試劑等。貯液瓶分為各種不同規(guī)格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。b)吸管：主要分為刻度吸管、無刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、轉(zhuǎn)移液體，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等規(guī)格。無刻度吸管分為直頭吸管及彎頭吸管，除可以作吸取、轉(zhuǎn)移液體外，彎頭尖吸管還常用于吹打、混勻及傳代細(xì)胞。c)加樣器（移液器）：用于吸取、移動(dòng)液體或滴加樣本。可根據(jù)需要調(diào)節(jié)量的大小，吸量準(zhǔn)確、方便。尤以微量加樣器，可保證實(shí)驗(yàn)樣品（或試劑）含量精確，重復(fù)性良好。c）其他用品：尚有收集細(xì)胞用的離心管，放置試劑或臨時(shí)插置吸管用的試管，裝放吸管以便消毒的玻璃或不銹鋼容器，用于存放小件培養(yǎng)物品便于高壓消毒的鋁制飯盒或貯槽，套于吸管頂部的橡膠吸頭，封閉各種瓶、管的膠塞、蓋子、凍存細(xì)胞用的安瓿或凍存管、不同規(guī)格的注射器、燒杯和量筒以及漏斗，超凈工作臺(tái)使用的酒精燈，供實(shí)驗(yàn)人員操作前清潔消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型噴壺等。2.2.3器械：主要用于解剖、取材、剪切組織及操作時(shí)持取物件。常用的有：手術(shù)刀或解剖刀、手術(shù)剪或解剖剪（彎剪及直剪），用于解剖動(dòng)物、分離及切剪組織，制備原代培養(yǎng)的材料；眼科虹膜小剪（彎剪或直剪），用于將組織材料剪成小塊；血管鉗及組織鑷、眼科鑷（彎、直），用于持取無菌物品（如小蓋玻片）夾持組織等；口腔科探針或代用品，用以放置原代培養(yǎng)之組織小塊。3.常用操作3.1可調(diào)式移液器的使用手柄蓋操作按鈕手柄蓋操作按鈕顯示窗管嘴推出器手柄管嘴推出環(huán)管管嘴圓錐操作桿1、正確拿法：將移液器的把手朝外，四指并列放于把手下方，用拇指按住移液器按鈕。2、量程調(diào)節(jié)：將旋鈕調(diào)至所需刻度處，注意不可超出最大量程。3、安裝吸頭：將吸頭放在吸頭盒中，將移液器的前部插入吸頭中，用力插兩下，拿出即可。4、預(yù)洗吸頭：新裝吸頭或增加容量后，首先應(yīng)該把需要轉(zhuǎn)移的液體吸取、排放兩三次，使吸頭內(nèi)壁形成一道同質(zhì)液膜，提前移液工作的精準(zhǔn)度，使整個(gè)移液過程具有極高的重現(xiàn)性。5、取液：按下按鈕到第一停點(diǎn)（推動(dòng)按鈕內(nèi)部的活塞分2段行程，第一檔為吸液，第二檔為放液，手感十分清楚）。將管嘴沒入液面下2-3mm（浸入過深，液壓會(huì)對(duì)吸液的精確度產(chǎn)生一定的影響），輕緩松開按鈕回到開始位置。仔細(xì)提上管嘴并在容器壁上停靠一下，以去除多余液體。6、放液：輕按按鈕至第一停點(diǎn)，液體即被排出；稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)（即吹出），這一步驟將排空管嘴，保證液體準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移。若還有殘留液體的話，需要更換吸頭或移液器。7、反向移液：使用該技術(shù)將吸入多于設(shè)置量程的液體，而移液不用吹出功能，這樣多余液體仍留在管嘴中。在轉(zhuǎn)移高粘度液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量液體時(shí)建議使用該技術(shù)。3.2pH試紙檢測溶液1）用滴管吸取待測液，滴在pH試紙上（可將整條試紙剪成小片），并在半分鐘內(nèi)與比色卡比較，讀出pH；2）用玻璃棒取待測液，涂在pH試紙上，并在半分鐘內(nèi)與比色卡比較，讀出pH；切忌不要將pH試紙浸入待測液，因?yàn)樵嚰埥氪郎y液會(huì)有指示劑流失，從而導(dǎo)致所測值不準(zhǔn)，而指示劑流失的同時(shí)，會(huì)污染待測液。3.3核酸濃度檢測DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1μg/ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD260＝0.02；當(dāng)OD260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50μg/ml；ssDNA濃度約為37μg/ml；RNA濃度約為40μg/ml；寡核苷酸濃度約為30μg/ml（底物不同有差異）當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。一般情況下同時(shí)檢測同一樣品的OD260和OD280，計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。經(jīng)驗(yàn)值：純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）；純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）。若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量。3.4電泳原理：生物大分子（如蛋白質(zhì)，核酸，多糖等）大多都有陽離子和陰離子基團(tuán),稱為兩性離子。常以顆粒分散在溶液中，它們的靜電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中,帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于它們帶電的符號(hào),這種遷移現(xiàn)象即所謂電泳。電泳的樣品支持物，生物實(shí)驗(yàn)大多為凝膠。水平電泳：用瓊脂糖凝膠作支持物的電泳法。借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動(dòng)速度有差異而分離。是基因操作中常用的重要方法。垂直電泳：用于分離蛋白質(zhì)和寡糖核苷酸。聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。轉(zhuǎn)移電泳：將混雜的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜上，再用標(biāo)記的抗體或二抗與之反應(yīng)，以顯示膜上特定的蛋白條帶。

第二章細(xì)胞與分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)核酸的凝膠電泳；聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)實(shí)時(shí)定量PCR重組DNA技術(shù)RNA基本操作技術(shù)核酸雜交探針蛋白質(zhì)電泳技術(shù)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)原位雜交技術(shù)SNP的理論與應(yīng)用基因突變與敲除2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡使用技術(shù)熒光顯微鏡使用技術(shù)細(xì)胞流式儀分析技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞器染色技術(shù)細(xì)胞活性測定技術(shù)細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞染色體分離與顯帶技術(shù)

第三章細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一考馬斯亮藍(lán)染色法顯示細(xì)胞骨架【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私饧?xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及制備技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中由蛋白質(zhì)聚合而成的三維網(wǎng)架體系。細(xì)胞骨架可以分為微管、微絲和中間纖維三大類，它們都是由各自的蛋白質(zhì)聚合而成的蛋白質(zhì)纖維狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞中組織成特定的排列方式，以執(zhí)行特定的功能。用非離子型表面活性劑TritonX-100處理細(xì)胞，可以溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解掉，剩下細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白不被溶解，然后用蛋白染料考馬斯亮藍(lán)染色即可顯示骨架結(jié)構(gòu)。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料：體外培養(yǎng)的貼壁生長細(xì)胞2.試劑：（1）M緩沖液，配方為：咪唑50mmol/L；KCl50mmol/L；MgCl20.5mmol/L；EGTA1mmol/L；EDTA0.1mmol/L；巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）1mmol/L；用1mol/L鹽酸調(diào)pH至7.2（2）6mmol/L（pH6.8）磷酸緩沖液，用NaHCO3調(diào)其pH。（3）1%TritonX-100：用M緩沖液配。（4）固定液：3%戊二醛，用M緩沖液配。（5）0.2%的考馬斯亮藍(lán)R250染液。其溶劑為：乙醇46.5mL；冰醋酸7mL；蒸餾水46.5mL3.用品：顯微鏡；1.5mLeppendorf管、蓋玻片【操作步驟】1.將細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上。取出蓋玻片，用PBS洗3次。2.室溫下用1%TritonX-100處理20～30min。3.用M緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次。4.用3.0%戊二醛固定細(xì)胞10min。5.用PBS洗三次，濾紙吸干。6.用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色30min。蒸餾水沖洗，在空氣中自然晾干。7.在光學(xué)顯微鏡下觀察，可看到細(xì)胞骨架主要沿著細(xì)胞生長長軸成極性分布。【作業(yè)與思考題】1.考馬斯亮藍(lán)染色法顯示的細(xì)胞骨架能區(qū)分微絲、微管和中間纖維嗎？為什么？2.查閱資料說明M緩沖液各組分成分的作用。實(shí)驗(yàn)二臺(tái)盼藍(lán)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼门_(tái)盼藍(lán)染色法區(qū)分細(xì)胞死活的技術(shù)；掌握用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法【實(shí)驗(yàn)原理】活細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，不允許臺(tái)盼藍(lán)等水溶性染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；死細(xì)胞膜的完整性受到破壞，允許這些染料進(jìn)入細(xì)胞，據(jù)此可以用臺(tái)盼藍(lán)等染料染色鑒定細(xì)胞死活。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料：研磨組織產(chǎn)生的細(xì)胞、抗癌物質(zhì)處理過的癌細(xì)胞或沸水處理5min的細(xì)胞。2.試劑：0.4%的臺(tái)盼藍(lán)生理鹽水溶液：稱取0.4g臺(tái)盼藍(lán)染料，加少量水研磨粉碎；再加水至50mL，過濾；加入等量1.83.用品：1.5mL塑料離心管、膠頭吸管、顯微鏡等。【操作步驟】1.待檢細(xì)胞懸液與等體積的臺(tái)盼藍(lán)染液混合染色3~5min。2.制備裝片觀察死活細(xì)胞，并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞比率。死細(xì)胞染成藍(lán)色，灰暗、無折光性，細(xì)胞變大；活細(xì)胞不著色、折光強(qiáng)、大小正常。活細(xì)胞比率=（細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)染色細(xì)胞）/細(xì)胞總數(shù)×100%【注意事項(xiàng)】1.臺(tái)盼藍(lán)染料對(duì)細(xì)胞有一定毒性，染色時(shí)間不可過長，否則會(huì)導(dǎo)致死細(xì)胞比率增大。如果同時(shí)檢測多個(gè)細(xì)胞樣品，應(yīng)逐一加染液染色、計(jì)數(shù)，而不要一次性將多個(gè)細(xì)胞樣品同時(shí)加染液染色后再處理，否則后面檢查的細(xì)胞樣品得到的活細(xì)胞比率會(huì)比實(shí)際低。2.檢驗(yàn)活細(xì)胞時(shí)要盡可能快，以免計(jì)數(shù)板上的細(xì)胞脫水而死。【作業(yè)與思考題】除了臺(tái)盼藍(lán)染液，還有那些染液可用于細(xì)胞死活鑒定？實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私怏w外細(xì)胞傳代培養(yǎng)的方法及技術(shù)，觀察體外細(xì)胞的形態(tài)及生長情況。【實(shí)驗(yàn)原理】一些血清蛋白和培養(yǎng)細(xì)胞的膜表面黏附蛋白參與了細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與培養(yǎng)瓶、器皿壁的黏附，使細(xì)胞貼壁生長及互相連接成片。用胰蛋白酶分解這些蛋白可以使細(xì)胞間連接斷裂，細(xì)胞與培養(yǎng)瓶、皿底部分開。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料：融合度達(dá)到80%~90%的貼壁生長HeLa細(xì)胞。2.試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液；DMEM完全培養(yǎng)液（DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液90%，小牛血清10%，青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL）3.用品：超凈工作臺(tái)、純水儀、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒鍋、過濾器及0.22μm濾膜、CO2培養(yǎng)箱、冰箱、液氮罐、倒置顯微鏡、天平、離心機(jī)、水浴鍋、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。【操作步驟】1.清洗除培養(yǎng)液及死亡細(xì)胞：先倒掉原有的培養(yǎng)液，用D-Hanks清洗液培養(yǎng)物2次，以盡量去除培養(yǎng)液中的血清成分和死亡細(xì)胞。2.酶消化：加入2~3mL，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液、輕輕擺動(dòng)數(shù)次使胰蛋白酶溶液與細(xì)胞充分接觸后，吸出大部分胰蛋白酶，僅留下約0.5mL在培養(yǎng)瓶里；置培養(yǎng)瓶于倒置顯微鏡下監(jiān)測消化情況，待細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓球形時(shí)即可。這個(gè)過程大概需要1~3min。3.終止消化：當(dāng)確認(rèn)消化完全時(shí)，加入5mL新鮮的完全培養(yǎng)液終止消化。4.收集細(xì)胞：用吸管吸取培養(yǎng)瓶、皿中的培養(yǎng)液，有次序地沖洗整個(gè)瓶、皿底部，使90%以上的細(xì)胞與培養(yǎng)容器底部脫離，并充分分散（成團(tuán)細(xì)胞生長不良）。但吹打動(dòng)作不宜過猛，吹出液體力度適中，并避免產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)損傷細(xì)胞。5.分割培養(yǎng)：視細(xì)胞的多少，分別接種在2~3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。一般按1:2或1:3接種（即一個(gè)培養(yǎng)瓶、皿中消化下來的細(xì)胞接種于2個(gè)或3個(gè)同樣大小的培養(yǎng)瓶、皿中）。【注意事項(xiàng)】消化過度會(huì)損傷細(xì)胞，使其不能再次貼壁生長；消化不足則導(dǎo)致細(xì)胞難以從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣會(huì)損傷細(xì)胞。【作業(yè)與思考題】1.用酶消化細(xì)胞之前為什么用D-Hanks液清洗培養(yǎng)物而終止消化又是用完全培養(yǎng)液？2.對(duì)一種新的細(xì)胞株傳代時(shí)怎樣把握消化程度？實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私夂驼莆占?xì)胞凍存與復(fù)蘇的方法，能獨(dú)立完成細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇。【實(shí)驗(yàn)原理】在低于-70℃細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，這樣可以使細(xì)胞較好的存活。溫度由-1℃、-25℃、-80℃之后放入液氮內(nèi)（-196℃）。凍存時(shí)為了減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷，常常加入5%～15%的甘油或二甲亞砜（DMSO）。這兩種物質(zhì)在低溫下對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性，而且分子小，溶解度大，易于穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性；加上緩慢冷凍方法可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲透到細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少形成冰晶所造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇時(shí)把裝有細(xì)胞的凍存管直接放入37【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料：融合度達(dá)到80%~90%的貼壁生長HeLa細(xì)胞。2.試劑：（1）含20%小牛血清的培養(yǎng)液（2）凍存保護(hù)液（3）DMSO或甘油3.用品：普通冰箱、-30℃低溫冰箱、-80℃【操作步驟】細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)1.收集細(xì)胞：取2支eppendorf管，各加入1mL濃度約為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，1500r/min離心8min，棄上清液。2.分別用1mL培養(yǎng)液和凍存保護(hù)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入經(jīng)檢查無破裂的凍存管中。3.封口。一般用Parafilm封口膜，撕開纏繞幾圈。寫標(biāo)簽。4.凍存。4℃冰箱20~30min；-20℃低溫冰箱30min~1h；-80℃ 也可用20層紗布包裹或放入厚壁泡沫盒中，直接置于-80℃冰箱中凍存24h再投入液氮中。學(xué)生實(shí)驗(yàn)用-80細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)1.復(fù)溫。從液氮中取出凍存管，立即在37℃溫水中快速晃動(dòng)1~2min，2.吸取凍存保護(hù)液。將細(xì)胞凍存懸液移入帶蓋離心管中；加入約5mL培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；1000r/min離心5min，棄去上清液。3.檢查細(xì)胞活率。用1mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染料排除法檢查細(xì)胞存活率。【作業(yè)與思考題】1.比較不加冷凍保護(hù)劑和加兩種不同冷凍保護(hù)劑（甘油和DMSO）凍存后的細(xì)胞存活率。2.查閱資料了解冷凍保存時(shí)細(xì)胞濃度對(duì)凍存效果有無影響。3.細(xì)胞凍存時(shí)對(duì)冷凍管容量有什么要求？實(shí)驗(yàn)五PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私釶EG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的基本原理，初步掌握細(xì)胞融合技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞融合是指兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞通過質(zhì)膜融合形成單個(gè)雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象，結(jié)果產(chǎn)生雜交細(xì)胞。親本相同的融合細(xì)胞稱為同核體，反之稱為異核體。20世紀(jì)60年代首次體外人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合獲得成功以來，由于其應(yīng)用的廣泛性和廣闊前景，已逐步發(fā)展成為重要的細(xì)胞工程技術(shù)。人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合主要包括：病毒和化學(xué)融合劑及電融合和激光融合等方法。細(xì)胞融合能把親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，甚至毫無親緣關(guān)系的生物體細(xì)胞融合在一起，為遠(yuǎn)緣雜交架起了橋梁，是改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。PEG是乙二醇的多聚物，存在不同分子質(zhì)量的多聚體，它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組，此時(shí)相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能，從而使細(xì)胞之間發(fā)生融合。PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合，其融合效果受到以下因素影響：分子質(zhì)量及濃度、pH、處理時(shí)間和溫度等。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料（1）2%雞紅細(xì)胞懸液（2）5%小鼠腹水瘤細(xì)胞懸液2.試劑（1）50%PEG：稱取5g相對(duì)分子質(zhì)量1000的PEG，倒入帶蓋離心管中，沸水浴使PEG融化；將裝有熔化PEG的離心管轉(zhuǎn)入50℃水浴中，向管中加入5mL預(yù)熱至50℃的GKN液，立即用粗口吸管吹打混勻，然后用NaHCO3調(diào)pH至8.0，保存于（2）GKN液：NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO4·12H2O3.558g，NaH2PO4·H2O0.78g，葡萄糖2g，酚紅0.01g（可加可不加），加雙蒸水至1000mL。3.用品離心機(jī)、水浴鍋、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、離心管、離心機(jī)等。【操作步驟】1.吸取材料中的細(xì)胞懸液1ml（單獨(dú)一種或兩種混合），1000r/min離心5min，棄大部分上清液，約留0.1mL液體；或者棄去全部上清液。2.有手指輕彈離心管底部，使沉淀松散，然后將離心管放入37℃水浴中；吸取預(yù)熱至37℃的50%PEG0.5m3.終止PEG作用：加入8mL預(yù)熱至37℃4.除融合劑：1500r/min離心5min，棄去上清液；用1mlGKN液重懸細(xì)胞。制備裝片，顯微鏡觀察融合現(xiàn)象；計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞融合率（融合細(xì)胞核數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)的百分率）。融合細(xì)胞判斷：已初步融合的兩個(gè)細(xì)胞接觸處的細(xì)胞膜破壞，胞質(zhì)貫通。融合細(xì)胞核數(shù)融合細(xì)胞核數(shù)+未融合細(xì)胞核數(shù)【注意事項(xiàng)】1.防止PEG因降溫而凝固。加PEG時(shí)不要將裝有細(xì)胞的離心管和裝有PEG的離心管拿離水浴鍋。2.50%PEG處理時(shí)間不宜過長，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破壞或有多個(gè)細(xì)胞彼此融合形成巨大的合胞體。3.經(jīng)PEG處理后加液混勻時(shí)應(yīng)輕輕吹打，以免剛剛?cè)诤系募?xì)胞分開。【作業(yè)與思考題】1.多大相對(duì)分子質(zhì)量的PEG用于細(xì)胞融合較為合適？2.PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的理想融合率是多少？怎樣提高PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合率？實(shí)驗(yàn)六肝細(xì)胞的原代分離及培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^直接消化法分離小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，從而得到體外培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。【實(shí)驗(yàn)原理】肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞廣泛用于藥理學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)的研究，尤其在藥物研發(fā)方面，使用原代肝細(xì)胞可較經(jīng)濟(jì)和迅速地闡明藥物對(duì)藥物代謝酶的誘導(dǎo)或抑制作用，從而避免采用大量動(dòng)物進(jìn)行藥理效應(yīng)篩選。但原代肝細(xì)胞增殖能力差，不易長時(shí)間保存或長期培養(yǎng)，建立簡單易行的分離培養(yǎng)純化肝細(xì)胞的方法顯得十分重要。

體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的關(guān)鍵是如何分離得到形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝細(xì)胞。分離肝細(xì)胞方法主要分為非灌流的方法和灌流的方法。酶消化法包括胰酶消化和膠原酶消化。胰酶消化法是利用胰酶來破壞肝細(xì)胞之間的橋連,使肝細(xì)胞分離的一種方法。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.器具：中號(hào)燒杯，平皿，小鑷子，大鑷子，小剪子，血球計(jì)數(shù)板，手套，試管架、酒精噴壺，離心管（15/50mL），吸管、100目孔徑濾網(wǎng)、1mL移液器及Tip頭、研磨玻片2.試劑：胰酶、PBS緩沖液、臺(tái)盼蘭、75%酒精【操作步驟】1.將小鼠斷頸致死，置75%酒精燒杯泡2-3分鐘，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中。2.剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有PBS液的平皿中。3.用手術(shù)剪將臟器剪成小塊（～1mm3），玻片研磨后，轉(zhuǎn)到離心管，離心1000rpm，5min。4.視組織或細(xì)胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶，37℃中消化20分鐘，每隔5min振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。6.加PBS至50mL，用100目孔徑濾網(wǎng)濾過，除去未消化的大組織塊。7.1000rpm，離心5min，棄上清液。8.加入紅細(xì)胞裂解液（Tris-NH4Cl）5mL，沖散細(xì)胞，約2min，裂解紅細(xì)胞9.加入PBS至15mL，再離心一次，棄上清液。10.加入PBSl-2mL（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。11.臺(tái)盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量及比率，調(diào)節(jié)活細(xì)胞濃度至106/mL。【作業(yè)與思考題】1.簡述采用灌流方法分離肝細(xì)胞的技術(shù)有哪些？實(shí)驗(yàn)七M(jìn)TT法檢測細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆绽肕TT檢測細(xì)胞活力和增殖程度的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】MTT能被各種活細(xì)胞（哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞）攝取，在線粒體內(nèi)被脫氫酶還原，由黃色可溶性溶液轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘乃{(lán)紫色甲臜顆粒，用一定的裂解液裂解細(xì)胞并溶解甲臜，再通過測定溶液的光吸收值就可以推測活細(xì)胞的存活情況和增殖程度。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料：腫瘤細(xì)胞2.試劑（1）RPMI1640培養(yǎng)液；（2）0.01mol/L,pH7.4的PBS緩沖液（磷酸二氫鈉NaH2PO4·2H2O0.45g；Na2HPO4·12H2O3.227g；氯化鈉8g；蒸餾水1000mL）（3）5mg/mL的MTT：用0.01mol/L,pH7.4的PBS緩沖液配制，溶解后用0.22μm濾膜過濾消毒，4℃（4）細(xì)胞裂解液：10%SDS-0.01mol/LHCl、DMSO或0.04mol/LHCl-異丙醇。3.儀器及用品CO2培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板、100ul槍及槍頭、酶標(biāo)儀、血球計(jì)數(shù)板等。【操作步驟】1.將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞先用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)濃度為8×106個(gè)/mL和8×105個(gè)/mL，然后分別進(jìn)行倍比稀釋，配成濃度為8×106個(gè)/mL、4×106個(gè)/mL、2×106個(gè)/mL、1×106個(gè)/mL、0.5×106個(gè)/mL和8×105個(gè)/mL、4×105個(gè)/mL、2×105個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、0.5×105個(gè)/mL兩個(gè)系列。2.將不同濃度的細(xì)胞懸液分別加入96孔培養(yǎng)板，每孔加入100uL，每濃度3個(gè)重復(fù)孔。3.每孔加入MTT溶液10uL，混勻后在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)44.置酶標(biāo)儀570nm處測定OD值。5.以密度為橫坐標(biāo)，MTT法測定的OD值為縱坐標(biāo)標(biāo)繪出兩條曲線，觀察MTT值與細(xì)胞密度之間的關(guān)系。【注意事項(xiàng)】1.甲臜應(yīng)完全溶解2.加入鹽酸異丙醇后要在1h內(nèi)進(jìn)行測定。若1h內(nèi)不能測定，可將未加鹽酸異丙醇的96孔培養(yǎng)板放在4℃【作業(yè)與思考題】1.細(xì)胞濃度與MTT測定值之間的關(guān)系如何？2.影響MTT法檢測結(jié)果可靠性的主要因素有哪些?

實(shí)驗(yàn)八涂片染色法觀察骨髓自然凋亡細(xì)胞【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆绽贸Ｒ?guī)染色法，觀察骨髓細(xì)胞的凋亡情況【實(shí)驗(yàn)原理】骨髓中造血干細(xì)胞發(fā)育為血細(xì)胞過程中有部分細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。細(xì)胞在凋亡過程中會(huì)發(fā)生一系列變化，如形態(tài)變化、DNA有規(guī)律的斷裂、膜表面物質(zhì)組成發(fā)生變化等。凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化主要體現(xiàn)在細(xì)胞核，首先出現(xiàn)染色質(zhì)凝結(jié)于中央異染色質(zhì)區(qū)域或核膜下，形成濃縮的染色質(zhì)塊，嗜堿性染色增強(qiáng)；隨著染色質(zhì)不斷凝聚，核膜在核孔處斷裂形成碎片，散布于細(xì)胞中；最后細(xì)胞核裂解為碎塊，核碎片和部分細(xì)胞質(zhì)由膜包被形成凋亡小體（程序死亡小體），從細(xì)胞表面出芽脫落。核的這些變化用普通染核染料或能與DNA結(jié)合的熒光染料都可以顯示出來。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.材料：小白鼠2.試劑（1）生理鹽水：0.9%氯化鈉；（2）甲醇；（3）0.067mol/L的PBS：Na2HPO4·12H2O11.81g；KH2PO44.5g，蒸餾水溶解并定容至1000mL。(4)吉姆薩染液儲(chǔ)存液：取0.5g吉姆薩粉末，加33mL純甘油，在研缽中研細(xì)；放在56℃恒溫水浴中保溫90min；再加入33mL（5）吉姆薩染液應(yīng)用液：用0.067mol/L的PBS將儲(chǔ)存液作1:20稀釋。3.用品：普通光學(xué)顯微鏡、離心機(jī)、剪刀、注射器及針頭、10mL離心管、膠頭滴管、載玻片等。【操作步驟】1.骨髓細(xì)胞的收集：頸椎脫臼法處死正常小白鼠：去除前、后腿部肌肉，從關(guān)節(jié)處卸下長骨；剪掉長骨兩端，用注射器吸取生理鹽水將骨髓腔內(nèi)細(xì)胞沖至離心管中；細(xì)胞懸液經(jīng)1000r/min離心8min，棄去大部分上清液，留少許上清液（約相當(dāng)于細(xì)胞沉淀的體積）重懸細(xì)胞。2.制備細(xì)胞懸液涂片：用膠頭滴管加1小滴（約10μL）細(xì)胞懸液于載玻片長軸一端離邊緣約1cm處中央。將有樣品的載玻片A放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)平坦之處，右手持另一張載玻片B作為推片。先用一側(cè)短邊邊緣接觸細(xì)胞前沿，待細(xì)胞沿載玻片B邊緣展開成線后，使載玻片B以與載玻片A呈30～45度角向前勻速移動(dòng)，將細(xì)胞推成厚薄適宜的細(xì)胞涂片。將推好的細(xì)胞涂片在空氣中晃動(dòng)，使其迅速干燥。3.固定：給載玻片上的細(xì)胞標(biāo)本處滴加甲醇，固定3min，若到時(shí)甲醇未干，可用吸水紙吸干。4.染色：用吉姆薩染液應(yīng)用液或在載玻片染色盒內(nèi)染色20～30min，流水沖去浮液，晾干標(biāo)本。5.結(jié)果觀察：正常細(xì)胞細(xì)胞核質(zhì)均勻，染成淡藍(lán)紫色；凋亡細(xì)胞染色質(zhì)凝集（深染）、邊緣化（靠近核膜）或有藍(lán)紫色凋亡小體出現(xiàn)在細(xì)胞外。【作業(yè)與思考題】1.除了形態(tài)觀察還有什么方法可用于檢測細(xì)胞凋亡？實(shí)驗(yàn)九人類外周血染色體標(biāo)本的制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)外周血淋巴細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的原理和方法，利用培養(yǎng)后進(jìn)行分裂的細(xì)胞制備人類染色體標(biāo)本。了解人類染色體的基本形態(tài)特點(diǎn)，為核型分析和原位雜交實(shí)驗(yàn)提供良好的染色體標(biāo)本。【實(shí)驗(yàn)原理】染色體作為細(xì)胞遺傳信息的載體，出現(xiàn)于有絲分裂期。用于人類染色體標(biāo)本制備的材料可為外周血淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、絨毛細(xì)胞或羊水細(xì)胞等。外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都處于G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。但是加入植物血凝素時(shí)，小淋巴細(xì)胞受刺激轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并開始進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)短期培養(yǎng)后，用秋水仙素處理、低滲、固定、滴片和染色，就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞進(jìn)行核型觀察。核型是指一個(gè)體細(xì)胞有絲分裂中期的所有染色體，并按其大小、形態(tài)特征順序排列所構(gòu)成的圖像。每一個(gè)體細(xì)胞含有兩組染色體，用2n表示。染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)的重要研究手段。在人類遺傳分析中普遍采用外周血培養(yǎng)的方法獲取分裂相細(xì)胞，進(jìn)而開展臨床和基礎(chǔ)遺傳學(xué)的研究，這對(duì)于遺傳疾病的檢出以及遺傳咨詢等工作發(fā)揮重要作用。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.器具：隔水式恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴箱，離心機(jī)，顯微鏡，刻度離心管、吸管、試管架，載玻片等。2.試劑：抗凝人外周血（淋巴細(xì)胞），培養(yǎng)液（可直接購制），仙水秋素（10μg/mL），0.075mol/LKCL低滲液，磷酸緩沖液（pH6.8），甲醇、冰醋酸、吉姆薩（Giemsa）原液【操作步驟】1.用一次性注射器抽取抗凝血1mL，將針頭插入RPMI1640培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶滴入24-28滴血，搖勻。置37℃2.在終止培養(yǎng)前2-3小時(shí)，加入秋水仙素，終濃度0.2μg/mL，輕輕搖勻，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.將培養(yǎng)物倒入刻度離心管內(nèi)，以1000r/min離心10分鐘，棄去上清液，留底層沉淀物。4.加入37℃預(yù)溫的0.075mol/LKCL低滲液8mL，用吸管混合均勻，置375.加入1mL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1），輕輕混合均勻，1000r/min離心6分鐘，棄去上清液。6.加入8mL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1），輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后，室溫下固定30min，1500r/min離心6分鐘，棄去上清液。7.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入0.2-0.4mL新配制的固定劑，輕度吹打細(xì)胞制成懸液。8.吸取少量細(xì)胞懸液，盡量高距離地滴2-3滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，氣干。9.取3滴吉姆薩原液加10滴磷酸緩沖液，溫勻后滴在玻片標(biāo)本上，染色6-8min。流水輕輕沖洗玻片背面，將染液沖掉；氣干。10.顯微鏡高倍鏡和油鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。【注意事項(xiàng)】秋水仙素的用量和作用時(shí)間、低滲和固定的處理。其中低滲處理很重要，處理時(shí)間很重要，處理時(shí)間過長則細(xì)胞膜過早破裂導(dǎo)致染色體丟失，處理時(shí)間不足則致染色體分散不好，不利于計(jì)數(shù)分析。【作業(yè)與思考題】1.簡述人類染色體制備的操作過程和基本原理2.總結(jié)人類染色體制備過程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)十【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆找让阜℅顯帶的技術(shù)；掌握G顯帶核型分析的基本過程和技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標(biāo)本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)。本世紀(jì)70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，且在眾多的顯帶技術(shù)中（Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶），G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。因?yàn)樗饕墙?jīng)蛋白酶處理被Giemsa染料染色后而顯帶，故稱之為G顯帶技術(shù)，其所顯示的帶紋分布在整個(gè)染色體上。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準(zhǔn)確的識(shí)別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)畸變。G顯帶因其方法簡便，重復(fù)性好，帶紋清晰且可長期保存而應(yīng)用最廣泛。G顯帶的機(jī)理，目前有多種說法。例如，Lee等（1973）認(rèn)為染色體上與DNA結(jié)合疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后這些區(qū)段成為淺帶，而那些組蛋白和DNA結(jié)合牢固的區(qū)段可被染成深帶。有人認(rèn)為，染色體顯帶現(xiàn)象是染色體本身存在著帶的結(jié)構(gòu)。比如用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時(shí)，就能直接觀察到帶的存在。用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚，隨顯帶方法不同，顯出來的帶特點(diǎn)也不一樣，說明帶的出現(xiàn)又與染料特異結(jié)合有關(guān)。一般認(rèn)為，易著色的陽性帶為含有AT多的染色體節(jié)段，相反，含GC多的染色體段則不易著色。總的來說，G顯帶的機(jī)理還未搞清。【實(shí)驗(yàn)用品和材料】1.器具：顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、烤箱、恒溫水浴箱、冰箱、染色缸等。2.材料：中期人類染色體標(biāo)本、0.25％的胰蛋白酶工作液、生理鹽水、Giemsa原液、Giemsa工作液、1mol/L磷酸緩沖液(pH4.0～4.5)。【操作步驟】1.將常規(guī)制備的人染色體玻片標(biāo)本(未染色的白片)置于37℃烤箱中處理2h，然后轉(zhuǎn)入372.取0.25％胰酶溶液5mL，倒入染色缸中，加入45mL生理鹽水lmol/LNaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成肉湯色(pH6.8～7.2)。3、將配好的胰蛋白酶工作液放人37℃4、將玻片標(biāo)本浸入胰蛋白酶液中，不斷擺動(dòng)使胰蛋白酶的作用均勻，處理4~5min(精確的時(shí)間自行摸索)。5.立即取出玻片，放人生理鹽水中漂洗兩次。6.將標(biāo)本浸入37℃7.自來水沖洗(用細(xì)水小心沖洗)，空氣干燥。8.鏡檢顯帶效果。在低倍鏡下選擇分散良好的長度適中的分裂相，轉(zhuǎn)換油鏡觀察，若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足；若染色體邊緣發(fā)毛為顯帶過頭，此時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況增減胰蛋白酶處理時(shí)間重新處理一張標(biāo)本。【注意事項(xiàng)】G顯帶過程中的關(guān)鍵因素包括胰蛋白酶的作用時(shí)間、pH和溫度等。其中胰蛋白酶溶液應(yīng)37℃【作業(yè)與思考題】1.制作人的G顯帶正常核型配對(duì)分析圖附：人類染色體G顯帶特征口訣一禿二蛇三蝶飄，四鞭炮五黑腰；六號(hào)是個(gè)小白臉，七上八下九苗條；十號(hào)長臂近帶好，十一低來十二高；十三四十五，下中上；十六q2縊痕大，十七長臂帶腳鐐；十八人小肚皮大，十九一點(diǎn)腰；二十頭重又腳輕，二十一像個(gè)葫蘆瓢；二十二頭戴小黑帽，X一擔(dān)挑，Y是黑腳

第四章生化分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一血清肌酸激酶活性測定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆彰富钚詼y定的基本原理，了解血清肌酸激酶活性測定的原理和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】肌酸激酶（creatinekinase，CK，EC）能可逆地催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP。肌酸與雙乙酰及α-萘酚結(jié)合生成紅色化合物。在一定的范圍內(nèi)，紅色的深淺與肌酸量成正比，進(jìn)而可求得血清中CK活性。在反應(yīng)體系中加入Mg2＋作激活劑；半胱氨酸供給巰基，保持CK活性中心必需基團(tuán)不被氧化；氫氧化鋇和硫酸鋅沉淀蛋白并終止反應(yīng)。磷酸肌酸＋ADPCK肌酸＋ATP肌酸＋雙乙酰＋α-萘酚Mg紅色化合物【試劑】1.Tris-HCl緩沖液（pH7.4）稱取Tris2.42g，溶于蒸餾水100ml中，加入0.2mol/L鹽酸88.8ml，無水硫酸鎂0.34g，調(diào)pH至7.4，室溫中可保存數(shù)月。2.0.012mol/L磷酸肌酸溶液稱取磷酸肌酸鈉鹽43.6mg，加蒸餾水溶解至10ml，保存于3.0.004mol/LADP溶液稱取ADP鈉鹽23.3mg，加蒸餾水溶解至10ml，保存于4.混合底物溶液臨用前將試劑（1）、（2）、（3）等量混合，在此混合底物溶液9ml中，加入鹽酸半胱氨酸31.5mg，調(diào)pH至7.4，置-20℃5.2.50g/L硫酸鋅溶液準(zhǔn)確稱取ZnSO4·7H26.3.60g氫氧化鋇溶液稱取氫氧化鋇[Ba（OH）2·8H2O]6g，溶于蒸餾水90ml中，煮沸數(shù)分鐘，冷卻后加蒸餾水至100ml，過濾。取50g/L硫酸鋅溶液5ml，加少量蒸餾水和酚酞指示劑2滴，用氫氧化鋇溶液滴定至粉紅色。根據(jù)滴定結(jié)果，用蒸餾水稀釋氫氧化鋇溶液溶液，使其恰好與等體積的硫酸鋅溶液中和。7.貯存堿溶液稱取氫氧化鈉30g，無水碳酸鈉64g，加蒸餾水溶解，并稀釋至500ml，置塑料瓶保存。8.α-萘酚溶液α-萘酚400mg加貯存堿溶液10ml，須新鮮配制，否則空白管吸光度增高。9.雙乙酰溶液先配成10g/L水溶液，置冰箱保存，臨用前用蒸餾水作20倍稀釋。10.1.7mmol/L肌酸標(biāo)準(zhǔn)液稱取無水肌酸22.3mg，加蒸餾水定容至100ml【操作步驟】【參考范圍】慣用單位0.5～3.6U/ml；國際單位8～60U/L。【作業(yè)與思考題】1.實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：將測定的結(jié)果和計(jì)算結(jié)果填寫至實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，分析結(jié)果，得出結(jié)論。2.血清肌酐激酶活性測定的臨床意義。3.通過酶活檢測而診斷的遺傳代謝病還有哪些？列出一個(gè)，結(jié)合遺傳與臨床特征加以分析。實(shí)驗(yàn)二血清銅藍(lán)蛋白測定實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆盏鞍诇y定的基本原理，了解血清銅藍(lán)蛋白測定的原理和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)是存在于血清、肝、腎中含銅的α2-糖蛋白，每個(gè)CP分子含有6～8個(gè)銅原子，其中Cu2+、Cu+各占一半，故呈藍(lán)色。CP具有鐵氧化還原酶活性，能使Fe2+氧化成Fe3+，又稱為亞鐵氧化酶(ferroxidase)。CP的酶活性相對(duì)而言是非專一性的，其催化的基質(zhì)包括一些多元醇、多元酚、多元胺等。可以用Fe2+、聯(lián)苯胺、對(duì)-苯二胺、N-N-二甲基苯二胺、鄰聯(lián)大回香胺等作為底物，測定其酶的活性，其最適pH在5.0～6.0之間。也可用免疫化學(xué)方法對(duì)CP進(jìn)行定量測定。以鄰聯(lián)大回香胺二鹽酸鹽作為底物，在CP的催化下生成淡棕黃色的產(chǎn)物，然后加酸終止反應(yīng)，并生成紫紅色的溶液。根據(jù)紫紅色顏色的深淺來判斷CP酶活性。【實(shí)驗(yàn)試劑】1.醋酸鹽緩沖液(pH5.0)：準(zhǔn)確稱取醋酸鈉(含三分子結(jié)晶水)13.608g或無水醋酸鈉8.204g溶解于蒸餾水中，倒入1L容量瓶中加蒸餾水至約990ml，再加入冰醋酸2.6ml，混勻后用0.1mol/LNaOH或冰醋酸校正pH至5.0，最后用蒸餾水補(bǔ)充體積至1000ml，于4℃2.9.0mol/L硫酸溶液3.7.88mmol/L鄰聯(lián)大回香胺二鹽酸鹽溶液:準(zhǔn)確稱取鄰聯(lián)大回香胺二鹽酸鹽250mg，加蒸餾水溶解并定容至100ml，貯存于棕色瓶中4℃保存，至少可穩(wěn)定3個(gè)月。【操作步驟】

試劑(ml)1管(5min

管)2

管(15min管)血清0.050.05醋酸鹽緩沖液0.750.7530℃鄰聯(lián)大回香胺二鹽酸鹽溶液(事先30℃0.20.2準(zhǔn)確反應(yīng)5min

后9.0mol/L硫酸溶液2.0(立即混勻，由水浴中取出)－準(zhǔn)確反應(yīng)10min后9.0mol/L硫酸溶液－2.0(立即混勻，由水浴中取出)用1cm光徑比色杯在540nm波長下測定吸光度值，蒸餾水調(diào)零。【計(jì)算】CP國際單位的定義為：在最適pH和底物濃度下，每分鐘能催化1umol底物所需的酶量為一個(gè)國際單位。＝(A15min-A5min)×6.34×102式中，A15min：15min管的吸光度；A5min

：5min

管的吸光度；9.46：吸光系數(shù)；10：孵育時(shí)間之差值；0.05：血清用量(ml)；3：反應(yīng)液總體積(ml)。【參考范圍】

62～140IU/L。【作業(yè)與思考題】：1.實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：將測定的結(jié)果和計(jì)算結(jié)果填寫至實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，分析結(jié)果，得出結(jié)論。2.、血清銅藍(lán)蛋白測定的臨床意義。

實(shí)驗(yàn)三外周血細(xì)胞基因組DNA的提取(NaI法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私馓崛NA的原理，掌握人外周血基因組DNA的提取方法。【實(shí)驗(yàn)原理】用NaI法提取白細(xì)胞中的DNA可用于Southern雜交、PCR等。例如做親子鑒定可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。從全血制備白細(xì)胞DNA，可用雙蒸水溶脹紅細(xì)胞及白細(xì)胞膜，釋放血紅蛋白及細(xì)胞核，使核酸處于易提取狀態(tài)，加NaI破核膜并使DNA從核蛋白中解離，用氯仿/異戊醇抽提使蛋白質(zhì)沉淀完全，DNA存在于上層水相中，以異丙醇沉淀DNA，離心去異丙醇，并重復(fù)操作一次，即可獲得白細(xì)胞DNA。【實(shí)驗(yàn)試劑】1.器具：離心機(jī)、振蕩器、Eppendorf管，移液器等。2.試劑：抗凝人外周血，雙蒸水，6MNaI溶液，氯仿/異戊醇，70％乙醇，TE溶液。【操作步驟】1.取外周抗凝血（全血）200ul于Eppendorf管中，12000rpm離心12min。2.棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。混勻后加6MNaI溶液200ul，充分搖勻20s。3.加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。4.取上層液350ul，加入另一新Eppendorf管中，加210ul異丙醇，重新?lián)u勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應(yīng)體系15000rpm離心12min，使沉淀緊貼Eppendorf管壁。5.棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動(dòng)，可輕輕顛倒混勻），以15000rpm離心12min。6.棄乙醇，敞開Eppendorf管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA，制成的DNA液-207.用DNA／RNACalculator檢測DNA的含量和純度。【作業(yè)與思考】1.實(shí)驗(yàn)報(bào)告：將人外周血基因組DNA提取的實(shí)驗(yàn)步驟寫在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，測定DNA含量，將測定的結(jié)果寫到實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，分析結(jié)果，得出結(jié)論。2.查資料寫明2個(gè)所查到的DNA提取的方法以及基本原理3.寫明NaI，氯仿/異戊醇以及異丙醇在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中的作用。實(shí)驗(yàn)四堿裂解法提取質(zhì)粒DNA【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私馓崛≠|(zhì)粒DNA的原理，掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。【實(shí)驗(yàn)材料】1.材料：含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，1.5ml塑料離心管,離心管架，槍頭及盒、衛(wèi)生紙。2.設(shè)備：微量移液器(20ul，200ul，1000ul)，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，恒溫水浴鍋，雙蒸水器，冰箱等。【試劑準(zhǔn)備】1.LB液體培養(yǎng)基：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌15分鐘。2.氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃3.溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。配制方法：1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min，貯存于4℃。4.溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS。配制方法：2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。5.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。配制方法：5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃6.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。7.無水乙醇；8.70%乙醇；9.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。配制方法：1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?MTrisCl（Tris(三羥甲基)氨基甲烷）：800mlH2O中溶解121gTris堿，用濃鹽酸調(diào)pH值，混勻后加水到1L；0.5MEDTA（乙二胺四乙酸）：700mlH2O中溶解186.1gNa2EDTA.2H2O，用10MNaOH調(diào)pH8.0(需約50ml)，補(bǔ)H2O到10.RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20【操作步驟】1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20mlLB（含Amp100ug/ml）液體培養(yǎng)基中，37℃2.取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，12000rmp離心1-2min。棄上清，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體盡可能流盡。3.菌體沉淀重懸浮于100ul溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩，使菌體分散混勻)。室溫下放置5-10min。4.加入新配制的溶液Ⅱ200ul，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩)，冰浴5min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖海孰x心管中菌液逐漸變清）。5.加入150ul預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置5min。12000rmp離心10min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。6.上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻,12000rmp離心10min（450ul的苯酚/氯仿/異戊醇）。7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，離心12000rmp×10min。8.棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp離心5min。9.吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。10.將沉淀溶于20ulTE緩沖液(pH8.0，含20ug/mlRnaseA，約4ul)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。11.用DNA／RNACalculator檢測DNA的含量和純度。【注意事項(xiàng)】1.提取過程應(yīng)盡量保持低溫。2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時(shí)間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。【作業(yè)與思考】1.實(shí)驗(yàn)報(bào)告：將堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn)步驟寫在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，測定DNA含量，將測定的結(jié)果寫到實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，分析結(jié)果，得出結(jié)論。2.根據(jù)以前學(xué)習(xí)的生物化學(xué)知識(shí)，簡要分析本實(shí)驗(yàn)中用到的各種試劑及其成分的主要作用。實(shí)驗(yàn)五聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆誔CR擴(kuò)增的基因原理，以及PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因的方法及操作過程【實(shí)驗(yàn)原理】PCR即聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異性DNA擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA、引物和４種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分3步：①變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。③延伸：在DNA聚合酶和4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，5'→3'的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)，以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2×106～7拷貝。綠色熒光蛋白來源于海洋生物水母，其基因可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光，GFPcDNA開放閱讀框架長度約714bp，編碼238個(gè)氨基酸殘基，其肽鏈內(nèi)部第65-67位絲氨酸－脫氫酪氨酸－甘氨酸通過自身環(huán)化和氧化形成一個(gè)發(fā)色基因，在長紫外波長或藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。綠色熒光蛋白是常用的報(bào)考基因之一。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀(FACS)中直接觀察基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)利用含綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，加入綠色熒光蛋白基因cDNA的上游和下游引物和4種dNTP底物，在TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。理論上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為720kb。【試劑與器材】1.上游引物:5′-TTGGTACCATGGCTAGCAAAGGAGAAG-3′，其序列含綠色熒光蛋白基因cDNA編碼區(qū)起始的19個(gè)核苷酸，其5'端含KpnI酶切位點(diǎn)。濃度為5pmol/ul即50ul反應(yīng)液中加25pmol綠色熒光蛋白基因。2.下游引物:5′-TAGGGCCCTTATTTGTAGAGCTCATCC-3′，與綠色熒光蛋白基因cDNA編碼區(qū)最后21個(gè)核苷酸互補(bǔ)，其5'端含ApaI酶切位點(diǎn)。濃度為5pmol/ul即50ul反應(yīng)液中加25pmol綠色熒光蛋白基因。3.DNA模板：綠色熒光蛋白基因cDNA質(zhì)粒，濃度為2ng/ul，50ul反應(yīng)液中加入10ng。4.10×buffer濃度（購買Taq酶有配套的Buffer）:500mmol/LKCl，100mmol/LTris-Cl，pH9.0，1%Triton-X1005.10×MgCl2即25mmol/L。6.dNTP2.5mmol/L分別取等體積的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四種混合即成。7.TaqDNA聚合酶（國產(chǎn)或進(jìn)口）：濃度為5U/ul，50ul反應(yīng)液中加1U。【操作步驟】1.取0.2mlPCR管，按下表操作，各成分終濃度如下：模板DNA50～100ngTaqDNA聚合酶0.5～1ul上游引物(10uM)1ul下游引物(10uM)1ul10×DNA聚合酶緩沖液2.5ul加雙蒸水至25ul(建議先算好體積，最先加)2.標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃5min預(yù)變性；94℃30s、50℃30s、3.置至4℃或-20【作業(yè)與思考】1.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的基本原理是什么？2.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在基因診斷和醫(yī)學(xué)研究中有何應(yīng)用？實(shí)驗(yàn)六限制性內(nèi)切酶消化實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.熟悉限制性內(nèi)切酶的作用原理，掌握質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切的方法及操作步驟。2.了解PCR-RFLP的基本原理【實(shí)驗(yàn)原理】載體質(zhì)粒DNA的多克隆位點(diǎn)上具有EcoRI,HindIII等限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。通過內(nèi)切酶的作用，可使質(zhì)粒DNA由環(huán)狀變?yōu)榫€狀。通過與未酶切的質(zhì)粒DNA及DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳比較，確定酶切點(diǎn)，獲得該質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。【試劑與器材】1.材料：經(jīng)構(gòu)建的pMD19T或其它外源DNA的重組質(zhì)粒。2.試劑：限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindIII。【操作步驟】PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶酶解PCR產(chǎn)物10ul10×酶解緩沖液2ul*EcoRIorHindIII（10u/uL）1-2ul加雙蒸水至30ul(建議先算好體積，最先加)置37℃PCR產(chǎn)物酶解片段的電泳分離。【作業(yè)與思考】1.如何進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，注意事項(xiàng)。2.什么是PCR-RFLP，怎么利用RFLP進(jìn)行致病基因連鎖分析。實(shí)驗(yàn)七瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解瓊脂糖凝膠電泳檢測的一般原理。2.掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】DNA分子攜帶負(fù)電荷，在一定電解質(zhì)緩沖