1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞練習目的基因的檢測與鑒定

目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的結構基因目的基因的獲取供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細胞內提取出來目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。獲得目的基因的方法

1）從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文庫？（p9）2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫：部分基因文庫(cDNA文庫)：2）2）人工合成3）利用PCR技術擴增目的基因含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據基因的有關信息：如基因表達的產物等。（p9）1.用一定的_________切割質粒，使其出現一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產生_________________。——

核心3.將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達載體的構建基因表達載體的構建——核心質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。

科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因(三)將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農桿菌、枯草桿菌等。將目的基因導入受體細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉化——目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——

感受態細胞吸收DNA分子(三)將目的基因導入受體細胞(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功分子檢測個體鑒定：①檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交PCR技術—聚合酶鏈式反應

原理：前提：條件：PCR擴增儀DNA雙鏈復制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制和緩沖液前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物。引物：一小段單鏈DNA或RNA，一般20～30個堿基，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。PCR擴增時為什么需要引物呢？類別項目

復制

轉錄場所特點模板原料酶能量堿基配對產物細胞核只有DNA的一條鏈四種核糖核苷酸RNA聚合酶ATPA-UC-GT-AG-C細胞核DNA的兩條鏈四種脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATPA-TC-GT-AG-C兩個雙鏈DNA分子一條單鏈mRNA邊解旋邊復制，半保留復制邊解旋邊轉錄5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補結合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ利用PCR技術擴增目的基因PCR技術中引物的作用PCR的意思是聚合酶鏈式反應，是一種擴增DNA的技術（就是復制DNA）DNA復制其實很復雜，DNA聚合酶有一種特性，他只能把脫氧核糖核酸接到一段現有的DNA或RNA上。第一個位置上的脫氧核糖核酸沒辦法弄到了。在人體內這個部分是由RNA聚合酶完成的，先由這個酶在基因的第一段復制出一小段RNA，然后再由DNA聚合酶在后面添上以后的DNA。這段RNA就叫RNA引物。等都填完后再由引物酶把這段RNA切掉換成DNA。

PCR中可以用已經合成的DNA引物來代替RNA引物，這些就是引物的作用PCR技術擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復性（55℃-60℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成1）反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法：2.微生物作受體細胞原因：將目的基因導入微生物細胞3.轉化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少

處理細胞→

細胞→表達載體與感受態細胞混合→_________細胞吸收DNA分子。Ca2+感受態感受態1.常用菌：

目的基因插入Ti質粒的T-DNA上農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩定和表達1.農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質粒的T-DNA可轉移至受體細胞的染色體上2.轉化如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經轉錄。

不能，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。

例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。無表達產物無表達產物有表達產物無表達產物

細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產物。淘汰無表達產物的菌落，保留有表達產物的進一步培養、研究。基因文庫的構建（1）構建基因組文庫將某種生物體內的DNA全部提取出來，選用適當的限制酶，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后將這些片段分別與載體連接起來，導入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都含有了一段不同的DNA片段。這個群體包含了這種生物的所有基因。供體細胞中的DNA許多DNA片段載體限制酶分別與載體連接，載入受體菌導入鳥槍法（散彈射擊法）讓供體細胞提供的所有DNA片段分別在各個受體菌中大量復制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再利用一定方法將目的基因的DNA片段分離出來。外源DNA擴增產生特定性狀目的基因分離通過對受體菌的培養而儲存基因（2）構建cDNA文庫用某種生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的多種互補DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群體叫做這種生物cDNA文庫。1.下表關于基因工程中有關基因操作的名詞及對應的內容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細胞中提取④利用PCR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥3.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細胞在自然環境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導入進行檢測C．增加質粒分子的分子量D．便于與外源基因連接4.

有關基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時才用B．重組質粒的形成是在細胞內完成的C．質粒都可作為運載體D．蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料5.哪項不是基因表達載體的組成部分()A.啟動子B.終止密碼

C.標記基因D.目的基因6.下列