選修三現代生物科技專題教學目標：簡述DNA重組技術所需要三種工具的作用；認同基因工程的誕生和發展離不開理論研究和技術創新教學重點：DNA重組技術所需要三種工具的作用教學難點：基因工程載體需要具備的條件1指按照人們的愿望,進行嚴格的設計并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作DNA重組技術或基因拼接技術。別名操作環境操作對象操作水平基本過程原理基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導入→表達基因重組基因工程蘇云金芽孢桿菌體內有一種毒蛋白基因，它編碼的蛋白質可以使害蟲死亡，但對哺乳動物無毒害作用。棉花常常因害蟲而減產。能讓棉花擁有該基因變成抗蟲棉就好了——要實現它大致應該怎么操作、可能需要什么工具？同學們討論一下。問題探討：如何將蘇云金芽孢桿菌細胞內的抗蟲基因從它的DNA分子中切割下來？如何將切下來的抗蟲基因與運載體DNA連接起來？如何將重組的DNA運送到棉花細胞？需要切割DNA的工具（分子手術刀）需要連接DNA片斷的工具

（分子縫合針）需要基因轉移的工具（分子運輸車）

——限制性核酸內切酶——DNA連接酶——基因載體思考識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是原核生物4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結果：形成兩種末端一、“分子手術刀”——限制性核酸內切酶黏性末端平末端專一性

1、大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開形成黏性末端。2、SmaⅠ能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端。常見的兩種限制酶EcoRIAAGTTCCTTAAGCTTAAGGAATTC識別GAATTC序列，并在G和A之間切開限制酶在切斷DNA時，可在切口處帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間堿基正好互補配對，因此稱這些片斷為黏性末端。AATTGCCTTAAG3’5’3’3’5’5’5’3’AATTGCCTTAAGSmaⅠCCCGGGGGGCCC識別GGGCCC序列，并在G和C之間切開限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。CCCGGGGGGCCC

現有一長度為1000堿基對(bp）的DNA分子，用限制性核酸內切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1單獨酶切得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時酶切后得到200bp和600bp兩種長度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是練一練限制酶所識別的序列有什么特點？呈現堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。要想獲得某個特定性狀的基因必須用限制性核酸內切酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？切兩個切口，產生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性末端。思考

用限制酶切一個特定基因要切斷幾個磷酸二酯鍵？4個CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA2、DNA連接酶三、基因工程的基本工具類型來源功能相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第5頁“DNA連接酶——分子縫合針”的相關內容，填寫下表把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，DNA連接酶的縫合作用T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但連接平末端的效率較低DNA連接酶的縫合作用

用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要形成幾個磷酸二酯鍵？2個下圖為三種限制酶BamHⅠ、Hind

Ⅲ和BglⅡ的識別序列及切點。它們切割出來的黏性末端可以互補配對的是：GGATCCCCTAGGAAGCTTTTCGAAAGATCTTCTAGABamHⅠHind

ⅢBglⅡGCCTAGGATCTAGATCCGATCTAG√√鞏固提高DNA聚合酶和DNA連接酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位雙鏈在兩DNA片斷之間形成磷酸二脂鍵單鏈將單個核苷酸加到已存在的核酸片斷3’末端形成磷酸二脂鍵基因進入受體細胞的載體

要讓一個從甲生物細胞內取出來的基因在乙生物體內進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內去！能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。假如外源基因導入受體細胞后不能復制會怎樣？作為載體如果沒有限制酶切割位點將怎樣？外源基因是否進入受體細胞，你如何去察覺？如果載體對受體細胞有害將怎樣？會在細胞增殖中丟失

外源的基因不可能插入

如果載體上有遺傳標記基因，就可通過標記基因的表達來檢測。

將影響受體細胞新陳代謝，進而使轉入的外源基因也可能無法表達。三、基因工程的基本工具3、基因載體（運載體）

作為載體的必要條件1.能自我復制能進入受體生物細胞并在受體生物細胞內復制并表達；2.有一個至多個限制酶切位點能與目的基因結合3.有遺傳標記基因便于觀察4.對受體細胞無害、易分離安全、比較容易得到大腸桿菌結構模式圖DNA質粒載體結構模式圖目的基因插入位點氨芐青霉素抗性基因復制原點一個至多個限制酶切割位點有標記基因可以復制對受體細胞無害真正被用作載體的質粒，都是進行過人工改造的。三、基因工程的基本工具3、基因載體（運載體）

質粒（最常用）、λ噬菌體的衍生物和某些動植物病毒種類：不屬于質粒被選為基因運載體的理由是

A、能復制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標記基因

D、它是環狀DNAD練習4、下面是四種不同質粒的示意圖，其中ori為復制必需的序列，amp為氨芐青霉素抗性基因，tet為四環素抗性基因，箭頭表示一種限制性核酸內切酶的酶切位點。若要得到一個能在四環素培養基上生長而不能在氨芐青霉素培養基上生長的含重組的細胞，應選用的質粒是(

)C基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具具備的條件結構簡單,大小適中能在宿主細胞中自我復制并穩定存在具一個或多個限制酶切位點具標記基因質粒、λ噬菌體衍生物

、動植物病毒課堂小結：到哪里去找限制酶呢？生物易受外來DNA的入侵，比如病毒的入侵。在長期的進化過程中生物形成了一套完善的防御機制，比如動物有專門的免疫系統。而原核生物用來防止外來病原物的侵害的防御性工具就是限制酶，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割、使之失效，以保證自身的安全。那限制酶不會剪切細菌本身的DNA嗎？P7第2題通過長期的進化，當細菌中含有某種限制酶時，細菌本身的DNA分子中通常不具備這種限制酶的識別切割序列。這樣，細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

補充知識點：1.原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.(以模板轉錄然后脫落)28①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區非編碼區原核細胞的基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游啟動子終止子29真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不