3種拮抗菌制劑對西瓜枯萎病的拮抗作用

西瓜萎縮是西醫最重要的疾病之一。近年,由于西瓜種植面積不斷擴大,造成輪作困難,致使枯萎病的為害也逐年加重。重茬地一般發病率在30%左右,嚴重地高達80%以上,甚至絕產。目前,化學防治仍是控制西瓜枯萎病的主要措施,但由于長期大面積連續使用,防效已日漸降低。利用拮抗菌防治西瓜枯萎病越來越受到重視,國內已進行了用非致病鐮刀菌、熒光假單胞菌、綠色木霉以及哈茨木霉等防治該病害的試驗,但尚無聯合利用拮抗真菌和拮抗細菌防治西瓜枯萎病的報道。本文對綠色木霉TR-8和芽孢桿菌B67聯合防治西瓜枯萎病進行了初步研究。1材料和方法1.1微生物可濕性制劑西瓜枯萎病菌由沈陽農業大學生物農藥工程中心分離;50%多菌靈可濕性粉劑,江蘇省新沂農藥廠生產;0.5%施特靈水劑,河北省南宮生物化工廠生產;西瓜品種為鄭雜九號,合肥豐樂種業股份有限公司繁育。1.2生長抑制率測定在遼寧省各地采集健康西瓜或黃瓜的根際土壤及幼根,分別采用土壤稀釋法和根組織分離法,于PDA、NA和選擇性培養基cPCAT上進行分離。分離得到的木霉菌和細菌經反復純化,轉移到斜面(PDA或NA)上,4℃下保存。將木霉菌和西瓜枯萎病菌擴繁,打取直徑6mm的菌餅,PDA平板上于25℃下對峙培養5d后,測量菌落半徑,計算病原菌生長抑制率。用接種環取一環分離得到的細菌,在PDA平板中間劃一直線,于直線兩側相距2cm處分別接一直徑為6mm的西瓜枯萎病菌菌餅,以只接病原菌者作對照,于27℃下培養3d后,測量病原菌向細菌方向生長的距離,以R值表示拮抗作用的大小。1.3tr-8、s1e-7e-7e-d的配制將拮抗木霉和拮抗細菌在各自特定發酵培養基內恒溫振蕩培養7d后,取發酵物與營養載體混合,分別配制成108cfu/g的TR-8制劑、1010cfu/g的B67制劑和109cfu/g的健根寶粉劑(TR-8∶B67=1∶1)。1.4西瓜幼苗期枯渙病西瓜枯萎病菌用玉米砂培養基于25℃培養10d后,與滅菌細土等比例混合制成菌砂土。取老菜田土,過篩滅菌后,以藥∶土=1∶60的比例拌入TR-8制劑、B67制劑、健根寶粉劑和多菌靈可濕性粉劑,裝入分苗營養缽中。每缽均勻拌入菌砂土3g,并移栽健康西瓜(1片真葉)幼苗1株,正常栽培管理。每處理30株,重復4次,以不拌藥者作對照。25d后取出西瓜苗,調查發病情況,計算病情指數和病指防效。西瓜幼苗期枯萎病分級標準:0級為莖內維管束正常,外部無癥狀;1級為莖內維管束1/4以下變色;3級為莖內維管束1/4～1/2變色;5級為莖內維管束1/2～3/4變色;7級為莖內維管束3/4以上變色,部分葉片萎蔫;9級為整株枯死。1.5條田塊、田塊設置田間試驗分別在沈陽市新城子區道義鎮和新民市柳河溝鎮進行。在道義鎮選擇連續三年種植西瓜的田塊,設健根寶1∶50、1∶60和1∶70拌過篩細土3個處理,以多菌靈1∶50拌過篩細土作藥劑對照,以不拌藥過篩細土作空白對照。將藥土均勻撒在播種穴內之后播種,每穴撒藥土100g。每處理15m2,重復3次。播種55d后調查發病情況,計算相對防效。在柳河溝鎮,選擇連續兩年種植西瓜的田塊,設健根寶400倍、500倍和600倍液灌根3個處理,以施特靈500倍液灌根作藥劑對照,以清水作空白對照。分別于5月20日和6月2日灌根,每株200ml。每處理20m2,重復3次。6月20日調查發病情況,計算相對防效。2結果與分析2.1細菌分離結果從分離的菌株中,共篩選出對西瓜枯萎病菌具有較強拮抗作用的木霉菌9株、細菌10株。拮抗作用測定表明,TR-8菌株對西瓜枯萎病菌的抑制作用最強;其次是TR-3菌株,培養5d后的生長抑制率分別達到39.47%和31.59%(表1)。經鑒定,TR-8菌株屬綠色木霉(Trichodermaviride)。TR-8生長速度極快,氣生菌絲茂盛,產孢量大。當將TR-8和西瓜枯萎病菌在同樣條件下分別純培養時,TR-8的生長速度略快于西瓜枯萎病菌;但當將兩者對峙培養時,TR-8生長速度基本正常,而西瓜枯萎病菌卻明顯受到抑制。在TR-8與西瓜枯萎病菌的菌絲交接處,后者菌絲變黃并停止生長。隨著TR-8的擴展,逐漸將西瓜枯萎病菌覆蓋,并產生大量木霉菌分生孢子。被全部覆蓋后,西瓜枯萎病菌停止生長,并漸漸干枯死亡。在分離篩選的細菌中,B67和B71菌株對西瓜枯萎病菌抑菌效果最明顯。對峙培養3d后R值分別為0.2222和0.3333(表2)。B67菌株繁殖生長速度最快,接種幾小時即可形成明顯菌落。經初步鑒定,B67屬芽孢桿菌(Bacillussp.)。觀察發現,西瓜枯萎病菌向拮抗細菌生長一定距離后停止生長,兩者之間形成明顯的拮抗帶。2.2根寶粉的病指防效室內人工接菌防治試驗結果(表3)表明,TR-8制劑、B67制劑和健根寶粉劑對西瓜枯萎病均具有一定的防治作用。尤以健根寶粉劑的病指防效最為突出,達到76.78%,顯著高于其它所有處理,與對照化學殺菌劑多菌靈的防效達極顯著差異水平。TR-8制劑和B67制劑與多菌靈的防效相當。試驗中還發現,經拮抗菌制劑尤其是健根寶粉劑和B67制劑處理的西瓜幼苗,不但枯萎病發病率明顯降低,而且幼苗長勢明顯健壯,葉色濃綠,根系發達。說明健根寶粉劑和B67制劑有促進植株生長的作用。2.3健根寶粉對西瓜生長和抗菌材料效果的影響在新城子區道義鎮進行的健根寶粉劑拌土于西瓜播種時穴施,健根寶粉劑1∶50和1∶60拌土穴施對西瓜枯萎病的相對防效比較理想,分別達84.20%和76.79%,顯著高于多菌靈的相對防效(表4)。拌土穴施健根寶粉劑處理的西瓜植株生長旺盛、健壯,葉片呈深綠色,這與室內防治試驗結果相似,進一步證明健根寶有促進植株生長的作用。在新民市柳河溝鎮,于發病前和發病初期連續用健根寶粉劑400倍或500倍液灌根兩次,對西瓜病枯萎病的相對防效可達78%以上,顯著高于對照藥劑施特靈(表5)。3健根寶制劑對西瓜枯渙病的防治西瓜枯萎病是一種典型系統性侵染的土傳病害,此病有潛伏侵染現象,幼苗感病多數表現不明顯,到成株開花結果期陸續顯癥,有的感病株甚至終年不顯癥。該病在西瓜重茬栽培情況下,發病更為嚴重。國內外雖已進行了大量的綜合防治技術研究,但直到目前為止,仍無根治良方。健根寶粉劑對西瓜枯萎病的防效高達80%以上,為防治西瓜枯萎病提供了一條新途徑。大量研究已經證明拮抗菌的作用機制主要有競爭作用、重寄生作用、抗生溶菌作用、促進植物生長及