慢性中耳炎細菌生物膜形成與細菌培養的相關性研究

細菌生物膜是細菌通過適應生存環境而形成的與漂浮狀態對應的存在形式。由于細菌生物膜的形成為細菌的生存提供了有效的保護,目前認為細菌生物膜是99%的細菌存在的主要方式。生物膜的形成導致細菌對抗菌藥物有極強的耐藥性,是造成許多慢性感染性疾病反復發作和久治不愈的主要原因,美國國家疾病控制中心認為細菌生物膜與超過65%的慢性感染有關。由于細菌生物膜結構比較復雜,需要特殊的檢查才能確定其存在,目前對于細菌生物膜的檢查方式主要是直接取材培養觀察、PCR、掃描電鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡以及微分干涉相差顯微鏡等。但這些方法受到經費及樣本的限制,很難直接應用到臨床中來。所以有必要研究更為簡單、實用的檢查方法來證實細菌生物膜的形成,為臨床慢性中耳炎的診療提供更為適用的依據。1數據和方法1.1入組情況及排除標準選擇2012-01-2013-06期間在新疆維吾爾自治區人民醫院接受手術治療的32例慢性中耳炎患者為研究對象,男15例,女17例;平均年齡34.8歲。所有患者均住院接受全面的術前檢查、純音測聽、聲導抗,全部行顳骨高分辨薄層CT掃描檢查,術前全身或局部均未使用抗菌藥物。均依據術后病理檢查結果來決定入組情況。患者根據中耳炎的臨床分類和手術分型指南(2012)入組,其中慢性化膿性中耳炎(活動期)患者16例,中耳膽脂瘤患者16例。入選標準:(1)年齡14~60歲,病程超過6周,臨床表現為耳溢液、鼓膜穿孔和聽力下降,耳內鏡和顳骨CT檢查提示慢性化膿性中耳乳突炎或膽脂瘤形成;(2)單側或雙側慢性中耳炎,具體病史不限,可以有手術史;(3)術后病理檢查結果符合慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤的診斷;(4)患者均在術前簽署知情同意書。排除標準:(1)急性化膿性中耳炎或慢性化膿性中耳炎急性發作者;(2)外耳道或中耳腔伴真菌感染者;(3)外傷后繼發感染者,外傷導致鼓膜穿孔者;(4)使用藥物、突發性聾、噪聲性聾導致的神經性聾患者;(5)伴糖尿病、風濕病、各種肝炎等全身性疾病,有嚴重器質性疾病、全身器官功能衰竭,無法耐受手術者。本研究已經通過新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審核同意,所有患者入組前均簽訂知情同意書。1.2實驗方法1.2.1電鏡掃描樣本慢性化膿性中耳炎(活動期)與中耳膽脂瘤患者接受乳突根治伴(不伴)鼓室成形,慢性化膿性中耳炎患者術中取2份中耳黏膜;中耳膽脂瘤患者在取中耳黏膜的同時取膽脂瘤上皮2份,一份送病理科行常規組織學檢查,另一份作為電鏡掃描樣本。電鏡掃描樣本在術中獲取后立即放入預冷(4℃以下)生理鹽水中漂洗,盡可能清洗掉標本表面的血液和分泌物,同時避免標本受擠壓損傷,然后放入2.5%戊二醛溶液中,置4℃的冰箱中保存。手術開始后,在保證沒有消毒液或者術腔沖洗的前提下,進入中鼓室或者乳突腔,用無菌生理鹽水濕潤的消毒棉拭子在患者術腔內沾取分秘物,按照嚴格無菌操作規范置入培養管內,立即送新疆維吾爾自治區人民醫院微生物室進行細菌培養及藥物敏感試驗檢查。1.2.2細菌生物膜檢測方法電鏡標本的制作及檢查:(1)標本在0.1mmoL/L的PBS液中沖洗3次,每次15min;(2)1%鋨酸固定1h,0.1mmol/LPBS沖洗2次,每次15min;(3)50%、70%、80%、90%的乙醇依次脫水,各15min;100%乙醇脫水2次,各15min;100%丙酮脫水15min;100%醋酸異戊酯15min;(4)CO2:臨界點干燥2~3h;(5)顯微鏡下將標本切開,用雙面膠帶紙粘于樣品臺上(由于中耳黏膜樣本較小,無法在取樣時立即區分正反面,所以在后期取標本的兩面進行觀察),置BC-Ⅱ離子濺射儀中進行真空噴金;(6)短期內盡快行掃描電鏡觀察,于KYKY-1000B掃描電子顯微鏡下觀察,通過WD-5掃描電鏡聯機圖像分析系統行數碼拍照保存。細菌生物膜存在的判斷方法:所有標本在送電鏡室以后均按照先后順序統一編號,進行盲法觀察,同時由2位高年資工作人員進行試驗結果的確認。電鏡結果判定參考文獻,細菌細胞外基質及細菌菌落形成典型三維結構,其內有被包埋的球形和橢圓形細菌結構(通常細菌大小在0.05~5.00μm),周圍或下方有水通道形成作為判定細菌生物膜形成的掃描電鏡下形態學特征。掃描電鏡看到以上結構,即判定存在細菌生物膜。試驗儀器:JSM-6000F掃描電鏡(Panasonic,Japan),加速電壓20kV。1.2.3細菌的培養和鑒定1.2.4菌株質控標準質控菌株:金黃色葡萄球菌(ATCC25923)用于GP卡和AST-GP61卡質控,陰溝腸桿菌ATCC700323用于GN卡質控,大腸桿菌(ATCC25922)用于AST-GN09卡質控,綠膿桿菌(ATCC27853)用于GN卡質控,上述標準菌株均由新疆維吾爾自治區衛生防疫站提供。方法:嚴格按照生產廠家說明復溶菌株,孵育,檢查純化,傳代試驗,并妥善進行儲存。1.3種實驗方法的對比研究實驗結果匯總統計后,均采用SPSS17.0軟件包進行統計學處理分析,組間細菌培養結果、觀察到細菌生物膜的差異采用校正的Fisher精確檢驗。評價2種實驗方法采用Pearson相關分析,依照相關系數進行評價。以P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1細菌生物膜結構32例慢性中耳炎患者中耳黏膜及膽脂瘤上皮行掃描電鏡檢查,27例存在不同形態的典型細菌生物膜結構,陽性率為84.4%(27/32);其中慢性化膿性中耳炎細菌生物膜陽性率為87.5%(14/16),中耳膽脂瘤患者中細菌生物膜陽性率為81.3%(13/16);2例中耳膽脂瘤患者上皮中發現了真菌形成的生物膜結構。見圖1、2。2.2細菌培養陽性率共培養出21種致病菌,培養陽性率為65.63%(21/32),其中慢性化膿性中耳炎(活動期)細菌培養陽性率為75.00%(12/16),中耳膽脂瘤細菌培養陽性率為56.25%(9/16);兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。慢性中耳炎掃描電鏡細菌生物膜結果與細菌培養結果之間的比較見表1。相對于電鏡掃描細菌生物膜形成的結果,細菌培養的靈敏度為70.37%,特異度為60.00%,誤診率為40.00%,漏診率為29.63%,陽性預測值為90.46%,陰性預測值為27.27%,正確率為68.75%,約登指數為30.37%,Pearson相關系數為0.232(P>0.05)。3細菌生物膜的檢測結果目前,國內外學者對于慢性中耳炎患者細菌生物膜陽性率的報道有所不同,但在多種慢性中耳炎中均可以證實有細菌生物膜的存在,研究結果不同可能與慢性中耳炎的疾病分類、地域分布及檢測方法有關。Homue54fe等2009年發現細菌生物膜在83%的兒童慢性分泌性中耳炎分泌物中存在,通過掃描電鏡發現80%的慢性分泌性中耳炎成人活檢黏膜中存在細菌生物膜。Lee等對行手術治療的患者切除的中耳黏膜組織進行掃描電鏡觀察,行乳突根治術患者中有6例發現細菌生物膜的存在。Saunders等用掃描電鏡檢查慢性化膿性中耳炎與中耳膽脂瘤患者的手術標本,證實2種中耳標本中均發現了細菌生物膜的存在,膽脂瘤性中耳炎發現率較高,為60%,慢性化膿性中耳炎為14.3%。Lampikoski等在2012年研究了慢性中耳炎患者有(無)膽脂瘤病變的標本,發現細菌生物膜形成在中耳膽脂瘤中的作用較大,為82%,而在慢性分泌性中耳炎中為42%。王冰等用掃描電鏡檢查10例慢性化膿性中耳炎中耳肉芽中9例有細菌生物膜的存在,其中1例標本破壞未做檢查,陽性率達到了100%。盡管細菌生物膜在慢性中耳炎中的研究工作已經取得進展,但由于各種原因導致細菌生物膜的檢出情況依然存在較大差異,如何使這些結果更科學、可靠,為臨床提供合理的指導還需要進一步深入研究。本研究中,掃描電鏡觀察細菌生物膜總體陽性率為84.4%,慢性化膿性中耳炎(活動期)為87.5%,中耳膽脂瘤為81.3%。實驗結果充分證實了慢性化膿性中耳炎(活動期)和中耳膽脂瘤中均有較高的細菌生物膜檢出率。我們對這2種疾病的細菌生物膜檢出率進行比較,發現其沒有差異,說明這2種慢性中耳炎在細菌生物膜的形成方面沒有差別,至于細菌生物膜在各自疾病的發生、發展過程中起到了何種作用,作用機制是否有差異,還需要進一步研究。雖然細菌生物膜在慢性中耳炎中的存在已經得到證實,但目前尚未見有學者報道慢性中耳炎細菌生物膜形成與細菌培養之間的關系及其相關性。徐瑞龍等進行了慢性鼻-鼻竇炎患者細菌生物膜表達與細菌培養的相關性研究,對90例慢性鼻竇炎患者的手術黏膜樣本進行細菌培養及掃描電鏡檢查,患者細菌生物膜陽性率為71.1%,其中66.7%細菌培養陽性;細菌培養與細菌生物膜間的Pearson相關系數為0.901(P<0.01),認為慢性鼻-鼻竇炎患者鼻黏膜中細菌生物膜表達與細菌培養陽性結果高度相關。這項研究充分證實了慢性鼻-鼻竇炎中細菌生物膜在不同階段有游離細菌游出,使慢性感染持續存在,影響疾病療效,鼻竇病變組織標本細菌培養結果可以反映細菌生物膜的形成情況。本研究在32例慢性中耳炎患者中共培養出21種致病菌株,慢性中耳炎患者中耳分泌物細菌培養陽性率為65.63%,慢性化膿性中耳炎患者和中耳膽脂瘤患者細菌培養陽性率差異無統計學意義。我們在后續的研究中將合并研究細菌生物膜形成與細菌培養之間的關系。本研究細菌培養陽性率較低,結合具體實驗過程,考慮與以下因素有關:(1)部分患者在入院前已經接受過局部或全身抗生素治療,但收集材料時患者未告知;(2)術中留取中耳分泌物有一定的局限性,不僅消毒時局部有消毒液滲入鼓室腔,導致細菌被殺滅,而且術中血液進入中耳腔,導致分泌物被稀釋,使獲得的樣本細菌數量減少,培養陽性率下降;(3)標本送檢周期較長,部分標本未立即送達微生物室;標本在微生物室留存時間較長,導致部分細菌死亡;(4)術中及在留取樣本時接觸到空氣,導致厭氧菌的檢出很困難;(5)常用的細菌培養液可能不能滿足部分細菌生長的需要,如厭氧菌、真菌等,故培養陽性率不高。針對以上原因,我們提出以下建議以便提高細菌鑒定和藥敏實驗的科學性:(1)嚴格按照衛生部抗菌藥物的使用要求,盡量杜絕患者自行使用抗菌藥物;(2)減少在留取標本期間對實驗標本的損壞、稀釋等;(3)懷疑有厭氧菌感染的標本盡量選擇特殊的培養液和培養方法。本研究通過對32例慢性中耳炎患者細菌生物膜檢查結果與細菌培養結果進行比較,發現其Pearson相關系數為0.232(P>0.05)。相對于掃描電鏡檢查來看,常規中耳分泌物細菌培養的靈敏度、特異度均較低。說明細菌培養結