第3章

植物細胞工程

___植物細胞培養與雜交

第3章

植物細胞工程

___植物細胞培養與雜交

1植物細胞工程通常采用的技術手段

植物組織培養植物體細胞雜交所采用技術的理論基礎植物細胞的全能性植物細胞工程通常采用的技術手段植物組織培養植物體細胞雜交21、定義：生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特性。2、原理：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質，都有發育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個活細胞都應該具有全能性。3、差異：（1）受精卵的全能性最高4、潛在全能性的原因：基因表達的選擇性（2）受精卵分化后的細胞中，體細胞的全能性比生殖細胞的低。一、細胞的全能性1、定義：生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特3二、植物組織培養概念科學研究表明，處于離體狀態的植物活細胞，在一定的營養物質、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現出全能性，發育成完整的植株。人工條件下實現的這一過程，就是植物組織培養。

二、植物組織培養概念4組織培養的分類據外植體不同:植株培養、器官培養、組織培養（含愈傷組織）據操作方法不同：固體培養、液體培養（包括振蕩培養、旋轉培養、靜止培養）組織培養的分類據外植體不同:植株培養、器官培養、組織培養（含5離體的植物器官、組織或細胞

(外植體)愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化。再分化脫分化產生的愈傷組織繼續進行培養又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細胞的再分化。二、植物組織培養植物組織培養過程離體的植物器官、組織或細胞(外植體)愈傷組織根植物6關于外植體的制備（一）培養材料（全能細胞）采集1、受精卵2、分生組織細胞：如分生組織、根尖、嫩莖、幼葉、花等的細胞快速繁殖多用莖尖細胞；無病毒培養多僅取莖尖分生組織細胞3、配子和單倍體細胞關于外植體的制備（一）培養材料（全能細胞）采集7（二）培養材料的消毒材料洗凈、瀝干、切成小塊

↓70%酒精或３-10％H2O2浸泡30-60s（無菌環境）↓消毒10min（飽和漂白粉液或0.01%HgCl2）↓無菌水沖洗干凈(3-4次)（二）培養材料的消毒8（三）制備外植體將消毒材料按培養要求進行處理如：切成0.2-0.5cm厚的小塊(片);去除芽的鱗片、嫩枝的外皮、種皮胚乳等。但葉片不需剝皮注意：整個過程無菌操作；嚴禁用手觸摸材料（三）制備外植體9離體的植物器官、組織或細胞

(外植體)愈傷組織根芽植物體脫分化再分化植物組織培養過程離體的植物器官、組織或細胞(外植體)愈傷組織根植物10關于接種與培養接種：外植體植入培養基上（4-10個/瓶）封口：培養瓶、管等用無菌材料密封愈傷組織培養：外植體膨大形成愈傷組織（脫分化）增殖：繼代培養與分化培養。25°C左右培養出新梢，分株或切段后于增殖培養基上繼續培養成芽苗關于接種與培養接種：外植體植入培養基上（4-10個/瓶）11含有全部營養成分的培養基、一定的溫度、空氣、無菌環境、適合的PH、適時光照等。二、植物組織培養3.植物組織培養條件：含有全部營養成分的培養基、一定的溫度、空氣、無菌環境、適合的12植物組培流程植物組培流程13無菌操作及操作車間無菌操作無菌操作車間無菌操作及操作車間無菌操作無菌操作車間14植物組培室植物組培室15關于培養基培養基大致由6種成分組成：（1）糖類（2）多種無機鹽類（3）微量元素（4）氨基酸、酰胺、嘌呤：如BA（5）維生素；生長素:如NAA、IBA目前以Ms（MurashigeandSkoog）培養基配方為最常用的一種基本培養基，它利于一般植物組織和細胞的快速生長。關于培養基培養基大致由6種成分組成：164.植物組織培養的應用：

（1）試管苗的快速繁殖（2）無病毒植物的培育（3）品種選育（4）人工種子（5）轉基因植物的培育4.植物組織培養的應用：17品種選育利用組織培養解決雜交育種中的種胚敗育問題，獲得了雜種子代，使遠緣雜交得以成功；用花藥培養和對未傳粉的子房進行離體培養，獲得了單倍體植株，從而開辟了單倍體育種的途徑；通過胚乳離體培養，獲得了三倍體植株，為改良農、林、果樹和蔬菜的三倍體育種提供了新的方法；品種選育利用組織培養解決雜交育種中的種胚敗育問題，獲得了雜種18人工種子所謂人工種子，就是將組織培養產生的體細胞胚或不定芽包裹在能提供養分的膠囊里，再在膠囊外包上一層具有保護功能和防止機械損傷的外膜，造成一種類似于種子的結構。人工種子所謂人工種子，就是將組織培養產生的體細胞胚或不定芽包19人工種子1978年Murashige提出人工種子歐共體將人工種子的研制列入“尤里卡”計劃.國外成功了胡蘿卜、苜蓿、芹菜、萵苣、花椰菜、花旗參、天竺葵等我國于1987年將其列入863計劃。經過20多年的努力，人工種子研究已取得了很大進展，成功了旱芹、花椰菜、雜交水稻等的人工種子。人工種子1978年Murashige提出人工種子20人工種子優點：結構完整，體積小，便于運輸和儲藏；體細胞繁殖快，占用空間小，可批量生產人工種子；可增加產品產量，改進商品品質，提高作物抗性；對于育性不佳的材料，可保持種質資源，不致退化。人工種子優點：21人工種子人工種子的制作人工種子人工種子的制作22離體植物細胞愈傷組織胚狀體根芽植物體脫分化再分化二、植物組織培養植物組織培養應用舉例（一）離體植愈傷組織胚狀體根芽植物體脫分化再分化二、植物組織培養23紫草紫草素愈傷組織二、植物組織培養植物組織培養應用舉例（二）紫草紫草素愈傷組織二、植物組織培養植物組織培養應用舉24胚狀體人工種皮人工胚乳二、植物組織培養植物組織培養應用舉例（三）人工種子胚狀體人工種皮人工胚乳二、植物組織培養植物組織培養25三、植物細胞培養1、定義與方法定義：指在離休條件下，將愈傷組織等置于液體培養基中振蕩培養，得到分散游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術。三、植物細胞培養1、定義與方法26方法:(1)據培養對象單細胞培養:單倍體培養:主要指花藥培養原生質體培養:(2)據培養系統懸浮培養;液體培養;固體培養固定化培養:將細胞包埋在海藻酸鹽中進行固體培養方法:272、培養基無機鹽：25mmol/L左右碳源：蔗糖或葡萄糖植物生長激素：生長素，如IAA;NAA分裂素,主要為腺嘌呤衍生物有機氮源:蛋白水解物有機酸復合物質:主要作細胞生長調節劑2、培養基283、植物細胞培養（1）單細胞制備方法機械法：酶解法：愈傷組織誘導法：高頻振蕩使愈傷組織分散成單個細胞3、植物細胞培養29(2)單細胞培養方法平板培養法:類似于微生物的平板培養看護培養:飼養層培養:液體淺層靜置培養:細胞懸浮培養:(2)單細胞培養方法30(3)細胞的保存繼代培養保存法:低溫培養法:一般5--10°C下培養保存冰凍保存:-20°C保存,可1--2年3、植物細胞培養應用紫杉醇、紫草寧、人參(3)細胞的保存31四、植物原生質體培養1、原生質體的制備（1）分離：機械法（質壁分離）酶解法（2）純化：離心沉降法漂浮法2、活性測定四、植物原生質體培養1、原生質體的制備323、原生質培養（1）液體培養：懸浮于液體培養基中，密度104---106個/毫升（2）固體平板：（3）雙層培養：在固體瓊脂培養基上加一薄層液體培養基，使固體培養與液體培養相結合，保持良好溫度利于原生質體生長。3、原生質培養334、植株再生（1）細胞壁再生：葉綠體重新排列，并合成新的