水產(chǎn)甲殼動物免疫防御機能的研究進展

甲殼動物的身體防御系統(tǒng)與動物和家禽一樣，主要包括細胞和體液因素。由于一部分體液因子是在細胞內(nèi)產(chǎn)生并發(fā)揮作用,所以將兩種免疫防御因子嚴格區(qū)分是很困難的。對細胞方面主要測定血細胞和固著性細胞的吞噬活性,以及由血細胞產(chǎn)生的包圍化及結節(jié)形成現(xiàn)象。對體液因子方面主要是酚氧化酶前體。1細胞免疫主要防御機能是通過吞食、包圍化以及形成結節(jié)來實現(xiàn)的。此外,由固著性細胞產(chǎn)生的吞噬作用和胞飲作用也是甲殼動物重要的機體防御機能。1.1甲殼動物外周血細胞形態(tài)變化的方法血細胞命名比較混亂,主要原因是不同的研究者在研究甲殼動物血細胞時所使用的方法有所不同,因為不同的抗凝劑、緩沖系統(tǒng)、試驗溫度、采血方法、保存時間、固定方法等,均可以導致甲殼動物血細胞的形態(tài)、細胞內(nèi)顆粒大小和著色性產(chǎn)生較大的差異,現(xiàn)在主要以內(nèi)含顆粒大小來命名。1.2甲殼動物細胞免疫功能檢測在水產(chǎn)甲殼動物中,具有清除外源蛋白類物質和病毒的胞飲能力的固著性細胞,主要有分布在鰓和觸角腺的足細胞、附著在心臟和肌纖維上并且具有吞噬作用的吞噬性貯藏細胞和在連接肝胰腺細動脈的洞樣血管內(nèi)的固著性吞噬細胞。目前,在對甲殼動物細胞免疫功能檢測指標大都集中在對血細胞的免疫指標的檢測方面。其檢測體系的檢測指標大體包括:總血細胞數(shù)(THC)和不同類型血細胞數(shù)(DHC)、血細胞吞噬能力的測定、血細胞的超微結構、血細胞酶細胞化學指標、血細胞胞內(nèi)酚氧化酶(PO)活性的檢測等。1.3紅細胞數(shù)目和血紅蛋白計數(shù)1.3.1總血細胞數(shù)(THC)的測定血球計數(shù)板一般有兩個計數(shù)室,每個計數(shù)室中刻有9個1mm2的大正方形,其中4個角落之正方形再細刻16個中方格,深度均為0.1mm。當計數(shù)室上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形的體積為1mm2×0.1mm=1.0×10-4mL。使用時,計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),再乘以104,即為每mL血淋巴液中的血細胞數(shù)目。血細胞數(shù)/mL=4個大方格的血細胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)。1.3.2不同類型的血細胞數(shù)(DHC)的測定血淋巴液中吸取0.2mL置于另一支1.5mLeppendorf離心管中,加入5%的甲醛溶液0.2mL,混勻以固定血細胞。然后吸1滴血淋巴液在載玻片上推片,每只蟹做3張血涂片,晾干后用甲醇固定,蒸餾水沖洗后用Giemsa染色5~10min,水洗,用95%的酒精分色10~30s,再用蒸餾水沖洗,自然晾干,鏡檢。在油鏡下,每張涂片隨機選取100個細胞,進行透明細胞、小顆粒細胞和顆粒細胞的鑒定和計數(shù)。1.3.3血細胞存活率的測定(臺盼藍染色排除法)臺盼藍染料不容易穿過活細胞的質膜(因質膜完整)進入胞內(nèi)使細胞著色,卻能滲入到死亡的細胞內(nèi)使其著色(死細胞被染成藍色),因此可藉此鑒別死活細胞。1.4紅細胞溶酶體酶細胞活性檢測血細胞吞噬作用是最普遍的細胞防御反應,它與體液因子共同組成表皮的物理化學屏障,成為抵御寄生物或其他侵襲者的第一道防線。吞噬細胞產(chǎn)生的溶酶體酶能有效地降解和消除異物,血細胞的吞噬作用只有通過檢測與吞噬作用相關的溶酶體酶如α-乙酸奈酯酶、β葡萄糖苷酸酶和酸性磷酸酶而間接地得到證實。血細胞溶酶體酶細胞化學變化作為甲殼免疫功能影響的評價指標之一。一般采用試劑盒法進行測定。其方法是:采集血淋巴制作血涂片,血涂片分別用購買的酸性磷酸酶染液,堿性磷酸酶(ALP)染色液,α-乙酸奈酯酶(α-NAE)染色液,β-葡萄糖苷酸酶染色液按試劑盒的說明進行染色制片,制片完畢后置光學顯微鏡的油鏡下,隨機選擇100個血細胞觀察、計數(shù)陽性血細胞的數(shù)量,陰性對照樣品對照。用公式N(+)/N(total)×100%計算酶染色陽性反應的血細胞的百分率,N(+)為陽性反應血細胞的數(shù)量,N(total)為計數(shù)的血細胞的總數(shù)。在計數(shù)陽性反應血細胞時,分別統(tǒng)計無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞的陽性反應細胞數(shù)量。1.5nbt還原法檢測o2-產(chǎn)物利用活性氧作為殺傷分子的氧化性殺菌機制代表了一種古老的自然免疫反應,無論是植物還是動物中都存在這種防御機制。它主要是指吞噬細胞的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生具有強大的殺菌活性的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)(O2-、H2O2、?OH、1O2),從而殺滅外來異物。NBT還原法測定O2-產(chǎn)物的原理是,當具有吞噬能力的血細胞受適當?shù)拇碳ぎa(chǎn)生呼吸爆發(fā)時,氧分子經(jīng)血細胞膜上的NADPH氧化酶催化,還原一個電子形成超氧陰離子(O2-),淺黃色的NBT經(jīng)O2-作用后被還原成不溶的藍黑色的甲臢(formazan),沉淀于血細胞胞漿內(nèi)。此時,用KOH溶液裂解血細胞并用二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臢沉淀,最后可用比色法測定O2-的產(chǎn)量(以630nm波長吸光值表示)。NBT還原法已經(jīng)廣泛應用于測定甲殼動物血細胞中O2-的產(chǎn)生,相對于其他方法而言,NBT還原法靈敏度稍差,但具有快速、簡便、可大量地進行樣品分析的優(yōu)點。1.6增設感染指數(shù)和事件指標將滅活的細菌或真菌注射到甲殼動物體內(nèi)或將新鮮的抗凝血與菌懸液混勻后孵育一定時間,血淋巴經(jīng)涂片、染色后顯微鏡下觀察計數(shù)。可獲得吞噬和殺傷百分率,吞噬和殺傷指數(shù)四個指標。吞噬率=(有吞噬作用的血細胞數(shù)/被計數(shù)的血細胞總數(shù))×100%殺傷率=(含殺死的細菌的血細胞數(shù)/被計數(shù)的血細胞總數(shù))×100%吞噬指數(shù)=血細胞內(nèi)總菌數(shù)(死菌+活菌)/計數(shù)100個血細胞殺傷指數(shù)=100個血細胞內(nèi)死菌數(shù)/100個血細胞內(nèi)總菌數(shù)(死菌+活菌)1.7電鏡葉片觀察此方法要求條件比較高,電鏡工作室的人員比較方便,一般都采取取樣固定后送提供電鏡制片觀察方面工作的電鏡測試中心進行。為了減少血凝過程對血細胞形態(tài)結構的影響,4℃預冷的PBS溶液配制的4%戊二醛固定液充分固定后備用。通過掃描電鏡和透射電鏡對細胞超顯微結構的觀察比較,從而對各種血細胞的結構與功能的變化做出判定。2體性因素的免疫2.1酚氧化酶原的激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)被認為是目前甲殼動物免疫系統(tǒng)中最重要的一種免疫機制,酚氧化酶活力的強弱與機體免疫有直接相關性,可作為衡量甲殼動物免疫功能大小的一個指標。因此胞內(nèi)酚氧化酶活性也可作為細胞免疫的一個指標。對酚氧化酶的活性的測定一般有兩個指標,即未經(jīng)胰蛋白酶處理的血細胞胞內(nèi)PO活性的測定和血細胞胞內(nèi)總PO活性的測定。甲殼動物的酚氧化酶原激活系統(tǒng)是由絲氨酸蛋白酶和其他因子組成的一個復雜的酶級聯(lián)系統(tǒng),無論從組成、激活方式還是從免疫功能上都非常類似于高等動物的補體系統(tǒng)。當病原微生物或寄生蟲等侵入機體后,其細胞壁結構成分(如真菌中的葡聚糖和革蘭陰性菌中的脂多糖等)作為非己信號按一定順序激活絲氨酸蛋白酶,絲氨酸蛋白酶隨后又激活酚氧化酶原,將其轉變?yōu)榛钚缘姆友趸?酚氧化酶是一種氧化還原酶,可氧化酚生成醌,醌自發(fā)形成最終產(chǎn)物——黑色素。黑色素及其形成過程中的中間產(chǎn)物均為高活性物質,通過多種方式參與宿主的防御反應,抑制病原體胞外蛋白酶和幾丁質酶的活性,從而在傷口愈合、抑制甚至殺死病原體方面發(fā)揮著重要作用。它還可能作為調(diào)理素,促進血細胞的吞噬和包裹作用,介導凝集和凝固。無脊椎動物受傷后在角質層、細菌感染后在結節(jié)處以及寄生蟲感染后的包囊形成過程中均有色素形成。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)黑色素和醌同時擔當殺菌酶的抑制劑和制真菌劑的作用。甲殼動物的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的因子是以非活性形式存在于顆粒和半顆粒細胞中。研究表明,proPO系統(tǒng)可以被多種物質所激活,包括來源于真菌的β-1,3-葡聚糖(β-1,3glucan,βG)和來源于細菌的肽聚糖(PG)、脂多糖(LPS)以及Ca2+、胰蛋白酶(Trypsin)、十二烷基肌氨酸鈉(SDS)。另外,加熱也可以激活proPO系統(tǒng)。這些物質是通過絲氨酸蛋白酶的作用而激活酚氧化酶的,而絲氨酸蛋白酶抑制劑能阻止這些物質對酚氧化酶原的激活作用。將血細胞破碎物上清液(HLS)作為酶源,并測定酶源的蛋白濃度。用96孔“U”底酶標板,在微孔中加入HLS和PBS,輕搖混勻后置濕盒中于28℃恒溫水浴鍋中溫育30min,隨后于每孔中加入L-3,4-二羥苯丙氨酸輕搖混勻后反應1min,再加入PBS(pH7.0)(預先于28℃下溫育)。由200μL預溫至28℃的PBS和100μLL-多巴組成的空白作底物單獨自氧化的對照。將酶標儀的工作溫度設定為28℃,固定吸收波長為490nm。將酶標板置于酶標儀中振蕩4次,立即測定反應體系的初始光吸收值,然后每隔2min讀取490nm處的吸光值。共讀取10次(即試驗反應周期設為20min)。空白對照為200μLPBS和100μLL-多巴。血細胞胞內(nèi)總PO活性的測定只要將PBS換成50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液即可。酶活力單位定義為:28℃下每毫克蛋白每分鐘OD490增加0.001為1個酶活力單位。此方法繁瑣,但可以比較有效地反應肌體免疫的強弱,是種有待推廣的高效檢測手段。2.2藥物的溶血作用溶血素作為一種非特異性免疫防御因子,已在多種無脊椎動物血清中發(fā)現(xiàn)。但有關甲殼動物溶血素的研究,僅限于日本對蝦、龍蝦、蟹等。溶血素的作用可能類似于脊椎動物的補體系統(tǒng),可溶解破壞異物細胞,參與調(diào)理作用,并可能與無脊椎動物的殺菌作用以及酚氧化酶原的激活系統(tǒng)有關。甲殼動物中的溶血素對熱不穩(wěn)定,并且可能被Ca2+螯合劑抑制,使其活性降低。無脊椎動物溶血素進行溶血作用的范圍一般較廣。溶血素具有溶解脊椎動物紅細胞的功能,代表了其識別和排除異種細胞的能力,在甲殼動物的體液免疫中發(fā)揮重要的防御作用。2.3美龍蝦的殺菌活性與昆蟲相比,對甲殼動物血液中殺菌活性物質的研究報道很少。美洲龍蝦的肝臟提取液及血清(包括血細胞成分)已經(jīng)被證明具有殺菌活性,而且對美洲龍蝦接種腐卵假單胞菌滅活菌苗后其殺菌活性會明顯上升。血細胞的吞噬活性具有促進作用,所以他們認為甲殼動物的植物凝血素能在血細胞吞噬活動中起調(diào)理作用。2.4細胞崩解法溶菌酶又稱胞壁質酶,它是一種堿性蛋白,主要殺滅革蘭氏陽性菌,能夠水解構成細菌細胞壁成分的多糖胞壁質中的N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵,從而使細菌的細胞壁破損,細胞崩解。在作用時可觀察到溶菌現(xiàn)象,故因此而得名。溶菌酶廣泛存在于各種動物的血細胞和血液中,在免疫活動中發(fā)揮著重要的作用。溶菌酶是吞噬細胞殺菌的物質基礎,當吞噬細胞對異物顆粒進行吞噬和包囊后,細胞內(nèi)的溶酶體會與異物進行融合,發(fā)生脫顆粒現(xiàn)象,外來入侵的微生物可以被其中的溶菌酶等直接殺死,隨后再進一步將它們水解消化,并將水解消化后的殘渣排出細胞外。溶菌活力可以作為檢測對蝦機體免疫功能狀態(tài)的一個有價值的參考。2.5清除活性氧物質超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶,作為活性氧參與清除體內(nèi)的自由基,在防御機體衰老及防止生物分子損傷等方面具有極為重要的作用。當微生物入侵被血細胞包裹后,機體產(chǎn)生一系列抗微生物物質,這些物質包括高活性氧種類,如超氧離子、過氧化氫、氫氧根離子和單線態(tài)氧。盡管氧是需氧細胞的必需成分,但同時,呼吸爆破中產(chǎn)生的高活性氧物質(ROS)也能引起潛在的細胞毒問題。因而有效而快速地清除活性氧物質是機體行使正常功能和存活的關鍵。這就由抗氧化防御機制來執(zhí)行,其中包括超氧化物歧化酶清除超氧離子。近年來的研究表明,SOD的活性與生物的免疫水平密切相關。健康的生物體,其內(nèi)環(huán)境中自由基的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)。SOD等酶具有消除自由基的功能,當SOD酶活性降低時,生物體內(nèi)會出現(xiàn)自由基過多,勢必擾亂、破壞體內(nèi)一些重要的生化過程,導致代謝混亂,正常生理功能失調(diào),體內(nèi)免疫水平下降,潛在的病原被激活,使對蝦發(fā)病。2.6不同氧狀態(tài)的動物所產(chǎn)生的酚氧化酶血藍蛋白是節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白,每個氧結合位點有2個銅原子,其氧的結合位點與另一種銅離子結合蛋白——酚氧化酶的氧結合位點的結構具有很高的相似性。血藍蛋白在脫氧狀態(tài)為無色,結合氧為藍色。它占甲殼動物血清總蛋白的60%~90%,在動物體內(nèi)發(fā)揮著呼吸作用,為動物提供充足的氧量。其主要功能是氧的載體,此外還具有調(diào)節(jié)滲透壓、儲存蛋白質、脫皮激素轉運和產(chǎn)生抗真菌肽等。而且,在胰島素、SDS和肌體內(nèi)凝集因子、抗菌肽等生物防御因子的作用下,能轉化為酚氧化酶。血藍蛋白裂解產(chǎn)生的抗微生物肽與對蝦的免疫反應有關。雖然到目前為止,血藍蛋白的加工機制還不十分清楚,但它們在甲殼動物免疫系統(tǒng)中所起的作用不容